Etiket Arşivleri: Mikrobiyoloji

Mikrobiyoloji

•İÇİNDEKİLER

Mikrobiyolojinin tanımı

Mikrobiyoloji’nin tarihçesi

Mikrobiyoloji’nin evreleri

Mikroorganizmaların insan yaşamındaki yeri

Mikroorganizmaların sınıflandırılması

Mikroorganizmaların adlandırılması

Dezenfektan ve antiseptik maddelerin etki mekanizmaları

Mikroorganizma enzimlerinin işlevini bozarak etki gösteren dezenfektanlar

Prokaryot, ökaryot hücreler

•MİKROBİYOLOJİNİN TANIMI

Mikrobiyoloji; gözle görülemeyecek kadar küçük canlıları inceleyen bir bilim dalıdır.

Mikrobiyoloji sözcüğü “mikros”, “bios” ve “logos” kelimelerinin birleşmesinden meydana gelmiştir.

Yunanca’da mikros küçük, bios yaşam, logos bilim anlamına gelmektedir.

  Mikrobiyoloji geniş kapsamlı bir bilim dalı olup, birçok dallara ayrılır. Bunların başlıcaları;

Tıbbi mikrobiyoloji

Tarım, toprak

Su mikrobiyolojisi

Endüstriyel mikrobiyoloji

Uzay mikrobiyolojisidir.

•MİKROBİYOLOJİ’ NİN TARİHÇESİ

Mikrobik hastalıklar eski uygarlık   dönemlerinde insanların ilgisini   çekmiştir. Eski Mısırlılar leprayı, trahomu,    dizanteriyi, bel soğukluğunu, Eski  Çinliler çiçeği, Hintliler kolerayı   tanıyorlardı. Üç bin yıl önce Filistinliler vebayı ve bu hastalığın farelerle ilişkili olduğunu biliyorlardı.

•MİKROBİYOLOJİ’ NİN EVRELERİ

1.Evre (M.Ö 5000-1675): Bocalama evresi

2.Evre (1675-1865): Gözlem evresi

3.Evre (1865-1882): Kültür- Ekim evresi

4.Evre (1882-1910): Fizyolojik çalışmalar

 evresi olmak üzere 4 döneme ayrılır.

•Spekülasyon Evresi

Hippcrates (M.Ö 460-370): Halk sağlığı ve hastalıkları konusunda 7 cilt kitap yazmış ve sıtma, lekeli humma, çiçek, veba gibi hastalıklar hakkında bilgi vermiştir.

Aristotoles  (m.ö. 384-322):Lebra,veba, verem gibi hastalıklar ile ilgili bilgi vermiştir.

İbn-i sina (M.Ö 980-1038): Hastalık etmenlerinin doğada olduğunu fakat bunların gözümüzün yapısı gereği göremediğimizi belirten ilk kişidir.

•Gözlem Evresi

Robert Koch (1843-1910) Mikroorganizmaların saf halde izole edilmesini, katı besiyerinde üretilmesini ve bakterilerin tespitinde büyük rol oynamıştır. Boyama yöntemini ilk olarak kullandı.

Leeuwenhoek Antonıe Van Hollandalı doğa bilimci. Geliştirdiği mikroskopla bakterileri hücrelileri ilk defa incelemiştir. 1677′de köpek,insan ve böceklerde sperm hücrelerini ilk kez tanımladı.

•Kültür – Ekim Evresi

Spallanzani:

1768’de hakkındaki kuramı üzerinde çalışmaya başladı.

Yaptığı deney mikropların havadan geldiğini ve kaynatma ile öldürülebileceklerini gösterdi.

Bu çalışma daha sonra Pasteur’un çalışmalarına ilham verecekti.

•Nicolas Appert

Gıdaların saklanabilmesi için konserve kutularını buldu.

Louis Pasteur (1822-1895) Pasteur içecekleri ısı işlemine tabi tutarak daha uzun süre muhafaza edilmesini ve patojen mikroorganizmalardan arındırılmasını sağlamış ve böylece ‘’pastörizasyon ‘’ metodunu bulmuştur. İnsanlık için korkunç bir hastalık olan kuduz, tavuk kolerası ve antraks (şarbon) aşılarını bulan da Pasteur olmuştur.

•Fizyolojik ( Araştırma) Evresi

Keşfin altın cağıdır.

1882-1902 hastalık yapan bakterilerin tanımı konulmuştur.

1928 antibiyotik bulunmuştur.

Penicilinden önce mikroorganizmaları hayvanlar ve bitkiler olarak adlandırılıyordu, mikroorganizmalar keşfedildikten sonra canlılar adını aldı.

•MİKROORGANİZMALARIN İNSAN YAŞAMINDAKİ YERİ

Ziraat

Hastalıklar

Enerji

Gıda

Biyoteknoloji

•MİKROORGANİZMALARIN SINIFLANDIRILMASI

Prokaryot hücreler: Belli bir çekirdekleri olmayan, kalıtım maddesi sitoplazmada dağınık halde bulunan çok basit hücrelerdir. Bunların zarları organelleri yoktur. Sadece ribozom organeli içerirler. Bakteriler ve mavi-yeşil algler prokaryot hücre yapısında canlılardır.

•Prokaryot Hücre Yapısı

Ökaryot Hücreler

Çekirdekleri ve zarla çevrili organelleri vardır. Çekirdek içinde DNA, RNA, özel çekirdek sıvısı ve çekirdekçik gibi yapılar bulunur.

Algler, protozoalar, mantarlar, küfler ve mayalar ökaryottur.

•PROKARYOTLAR VE ÖKARYOTLAR ARASINDAKİ FARKLAR

Ökaryotlar

Hücrede gerçek çekirdek var.

Nükleik asitler düz yapıdadır.

Nükleik asit sentezi belirli bir dönemde yapılır.

Çekirdekçik vardır.

Golgi cihazı vardır.

Algler, protozoalar, mantarlar, küfler bu grubun içerisinde yer alır.

Prokaryotlar

Hücrede çekirdek yoktur.

Nükleik asitler çembersel yapıdadır.

Nükleik asit sentezi sürekli yapılır.

Çekirdekçik yoktur.

Golgi cihazı yoktur.

Cyanobakreriler ve bakteriler bu grubun içerisinde yer alırlar.

•Biyolojik Sınıflandırma

Biyolojik sınıflandırma canlı özelliklerine veya filogenisine göre yapılabilir.

Canlı Özelliklerine Göre Sınıflandırma:

Çok yüzeysel sınıflandırma olduğu için günümüzde fazla kullanılmamaktadır.

Bitkileri ot, çalı, ağaç.

Hayvanları ise suda, karada ve havada yaşayanlar olarak sınıflandırmıştır.

Filogenetik (doğal ) sınıflandırma:

Bugün kullanılan sınıflandırma filogenetik  sınıflandırmadır.

Bu sınıflandırmada canlılar, anatomik, biyokimyasal, kalıtsal ve evrimsel  özelliklerine göre gruplandırılır.

Burada esas olan, canlılar arasındaki  akrabalık derecelerinin tayin edilmesidir.

Filogenetik sınıflandırmada çeşitli konular ele alınır. Bunlar evrim, homolog organlar ve   protein benzerliğidir.

•MİKROORGANİZMALARIN ADLANDIRILMASI

Mikroorganizmaların adlandırılmasında çift ad kullanılmaktadır.

Mikroorganizmaların adlandırılmasında kullanılan ilk ad cins adıdır ve büyük harf ile başlar. İkinci ad ise tür adıdır ve eğer özel isim değil ise mutlaka küçük harf ile yazılır.

Mikroorganizma adları italik harfler ile veya koyu renkte ya da olmazsa altları çizilerek yazılır. Örnek olarak Staphylococcus aureus.

•Viruslar

Canlı hücrelerde hastalık  yapan mikroskopik taneciktir.

Hücre yapısı göstermeyen ve tek başlarına metabolik aktiviteleri bulunmaz.

Virüslerin basitçe yapısında, ortada bir nükleik asit (DNA veya RNA) ve onu çevreleyen bir protein kılıf bulunur.

•Virüs Görünümü

Temizlik: Sağlığa zarar verecek, her ortamlardan korunmak için yapılacak uygulamalara temizlik  denir. Her kişi ya da her insan kendi temizliğinden sorumludur.

Hijyen: Patojen mikroorganizmaların vücudumuza transferlerini önlemek amacıyla yapılan uygulamalara hijyen denir.

Sterilizasyon: Bir yüzey üzerinde ki tüm zararlı ve zararsız mikroorganizmaların yok edilmesidir.

Sterilizasyon işlemi uygulanan maddeler ve aletler için bu işlemin tamamlanması sonucu tanımlama için steril kelimesi kullanılır.

Dezenfeksiyon: İnsanlarda hastalık yapma özelliği olan mikroorganizmaların uzaklaştırma işlemine denir.

Dezenfektan: Dezenfeksiyon işleminde kullanılan maddelere denir.

Dezenfeksiyonun, Sterilizasyondan  farkı yalnızca hastalık yapıcı ve zarar verici mikroorganizma ve canlıların hedef alınmasıdır sterilizasyon da ise ortamda ve eşyada bulunan tüm mikroorganizmaların yok edilmesi esastır.

Kontaminasyon: Steril olan bir ortama mikroorganizmaların bulaşması olayına kontaminasyon denir.

Patojen: Hastalık yapma özelliği olan  mikroorganizmalara denir.

Antisepsi: Deri gibi canlı dokular üzerine uygulanan dezenfeksiyon işlemine denir.

Bir ortam mikroorganizma içeriyorsa SEPTİK, içermiyorsa ASEPTİK ortak olarak tanımlanır. Örn. Septik( sınıf ortamı) aseptik ( laboratuar ortamı)

Sepsis: Patojen mikroorganizmaların canlı  dokuda üreyerek yayılmalarıdır.

Septisemi: Patojen mikroorganizmaların  kana karışması.

Bakteriyemi: Patojen  mikroorganizmaların  kanda bulunması.

Piyemi: Kanda irin oluşturan mikropların bulunması sonucunda ortaya çıkar yaygın enfeksiyondur.

Bakteriostatik: Bakteriler üzerine üremeyi durdurucu etki yapan maddelere denir.

Bakterisit: Öldürücü etkinlik gösteren maddelere  denir.

Sanitasyon: Hijyen ve sağlık koşullarının oluşturulması ve devam ettirilmesine denir. Geliştirilmiş atık uzaklaştırma yöntemleriyle çevrenin korunmasına katkı sağlar.

Pastörizasyon: Pastörizasyon patojen bakterilerden arındırılmak istenilen yiyecek ya da içeceklerin 100ºC’ nin altında ki sıcaklıkta ısıtılarak arındırılması işlemi. Genellikle sütlere ve süt ürünlerine uygulanan bir işlemdir.

PASTÖRİZASYON

Sadece hastalık  yapıcı bakterilerden arındırılır. Steril ürünlere göre raf ömrü kısadır. 100 C’nin altında işlem uygulanır.

STERİLİZASYON

Tüm mikroorganizmalardan arındırılır.

vRaf ömrü daha uzundur.

100 C’nin üstünde işlem uygulanır.

•Kimyasal Maddelerin Mikroorganizmalar Üzerine Etkileri

Dezenfektan maddenin konsantrasyonu: Dezenfektan maddenin etkisi konsantrasyonla doğru orantıda artmaktadır.

Etki süresi: Dezenfektan veya kimyasal maddenin mikroorganizmalar üzerine etkili olabilmesi için belirli bir süre geçmesi gerekir. Etki süresi uygulanan kimyasal maddeye ve uygulandığı ortam şartlarına göre değişir.

Isı: Isı arttıkça dezenfektan maddenin etkisi de buna paralel olarak artar. Her 10°Clik ısı artımı öldürmeyi en az bir kat arttırmaktadır.

PH: Ortamın Ph’sı ne kadar nötrden uzak olursa etki o denli artar.

Organik maddeler: Ortamda bulunan organik maddeler dezenfeksiyon işlemini olumsuz yönde etkiler.

Mikroorganizmaya bağlı etkiler: Mikroorganizmanın cins ve türleri ile, bulunduğu yaşam evresine dezenfektan maddelerin etkisi değişiktir. Örnek olarak sporlar bakterilerin üreyen şekillerine göre dezenfektan maddelere karşı oldukça dirençlidir. Ayrıca bakterilerin üreme fazları, sayıları ve diğer özel yapıların varlığı etkilidirler.

•DEZENFEKTAN VE ANTİSEPTİK MADDELERİN  ETKİ  MEKANİZMALARI

 Hücre zarına etkili dezenfektanlar: Yüzeydeki aktif maddeler, fenoller ve organik çözücüler gibi dezenfektanlar hücre sitoplazma zarının yapısını değiştirerek hücrenin aktif transportunu ve enerji metabolizmasını bozarlar.

Hücre proteinlerini denatüre eden maddeler; Bu dezenfektanlar mikroorganizmaların hücre geçirgenliğini kaybettirirler. Alkoller, fenol, sabunlar örnek gösterilebilir.

Mikrobiyoloji Ders Notları: Bakteriler

MİKROBİYOLOJİ DERS NOTLARI 1

DÜNYA ÖKARYOTLAR ( > 2 mikrometre ) : a) Algler b) Protozoonlar c) Mantarlar PROKARYOTLAR ( 0.2 – 5 mikrometre) : a) Arkebakteriler b) Siyanobakteriler (mavi-yeşil algler) c) Bakteriler Viruslar, viroidler ve prionlar ise bir hücre morfolojisine sahip olmayan yapılardır.Virüsler konak hücreye girerek onun genetik yapısındaymış gibi davranan kendisi için gerekli yapı taşlarını sentezletip hücreye zarar veren yapılardır. Yaklaşık 200-400 nm boyutlarında ancak elektron mikroskobu ile görülebilen canlılardır. En temel farklılıkları genetik yapı olarak ya sadece RNA ya da DNA içermeleridir . Viroidler kapsidsiz tek telli RNA viruslarıdır, otonom olarak hücre çekirdeğinde replike olabilirler ve bitki hastalıklarına yol açarlar. Diğer çıplak RNA‟ların aksine nükleazlara dirençlidir. Prionlar ise DNA ve RNA içermeyen protein yapılı etkenlerdir. İnsan (Kuru, Creutzfeld-Jacop,fatal familyal insomnia, Gertzman-Strausller sendromu) ve hayvanlarda (Scrapie, deli dana hastalığı,…vb) beyin hasarıyla karakterize klinik tablolar oluştururlar. Prionlar ısı ve dezenfektanlara çok dirençli, immun yanıt ve antikor oluşturmayan protein yapılardır . Nöronlarda vakuolizasyon ve amiloid plak birikimi ile karakterize süngerimsi (spongioform) ansefalopati tipik lezyondur. PrP protein yapısının önemli birimi ve infektiviteden sorumlu olduğu düşünülmektedir. Kısaca bakteriler (prokaryotlar) ökaryot mikroorganizmalardan boyutlarının daha küçük olması, stoplazmasında organeller içermemesi ve asıl önemlisi nükleer membranının bulunmaması ile ayrılırlar. Bazı özel durumları da burada hatırlamak faydalı olacaktır. SPĠROKETLER Burgumsu , özel yapılara sahip bakterilerdir. Periplazma kamçıları ve dingil telleri yapıları ile özel bir hareket yeteneğine sahiptir. İnsanda hastalık yapanları Treponema, Borrelia, Leptospira cinslerinde bulunur. Bakteriler arasında DNA genelde sirküler bir özellik gösterirken Borrelia burgdorferi lineer (DOĞRUSAL) bir DNA dizisine sahiptir. Spiroketler ince yapıları nedeniyle ancak karanlık alan mikroskoplarında gözlenebilirler.

Özellikler Viruslar Bakteriler Mantarlar Protozoonlar Hücre – Var Var Var Ortalama ölçüler (um) 0.02-0.2 1-5 3-10 15-25 Protozoon Nükleik asit DNA ya da RNA DNA+RNA DNA+RNA RNA+RNA Çekirdek tipi Yok Prokaryotik Ökaryotik Ökaryotik Ribozom Yok 70 S 80 S 80 S Mitokondri Yok Yok Var Var Dış yüzey yapısı Protein kapsid ve lipop- Peptidoglikanlı sert Kitinli sert duvar Esnek membran rotein zarf duvar Hareket Yok Bazılarında var Yok Pekçoğunda var Çoğalma şekli İkiye bölünmez İkiye bölünerek Bölünerek, eşeyli İkiye bölünerek eşeyli eşeysiz veya eşeysiz veya eşeysiz RĠKETSĠALAR Zorunlu hücreiçi paraziti olan küçük (300-600nm) bakterilerdir. RNA ve DNA birlikte içermeleri, ikiye bölünerek çoğalmaları ve hücre duvarı yapısına sahip olmaları nedeniyle viruslardan ayrılırlar. Tifüs etkeni olarak bilinirler ( R prowazekii, R typhi,…). Coxiella burnetii ( Q fever) , Ehrlichia cinsi bakteriler de bu aile içinde yer alırlar. Gram yöntemiyle iyi boyanmazlar, Giemsa , Gimenez boyalarıyla boyanırlar. KLAMĠDYALAR Küçük (200-1500nm) , zorunlu hücre içi bakterilerdir. Hücre içinde özel bir büyüme döngüsü oluşturur. Hücre içine giren bulaĢıcı yapı (elementer cisim) fagozom içinde metabolik olarak aktif olan retiküler cisim haline dönüşür. Retiküler cisimler ikiye bölünerek , içinde çok sayıda elementer cisimler oluşur ve hücre içinde inklüzyon cisimleri oluşur (Lugol ile boyanabilir). Sonuçta bu yapı parçalanarak elementer cisimler ortama dağılırlar. Nükleik asit, protein gibi yapıları sentezleme yetenekleri varken enerji üretimi için konak hücre enzimlerini kullanırlar (enerji parazitliği). Hücre duvarında peptidoglikan yapı bulunmaz. MOLLĠKÜLĠTLER Mycoplasma ve Ureaplasma cinsi bakteriler kültürleri yapılabilen en küçük prokaryotlardır (0.12-0.25 mikrometre) . Bu bakteriler sitoplazmik membranlarında sterol içeren yegane bakteriler olarak özel bir yere sahiptir. M. pneumoniae (atipik pnömoni) , M. hominis (ürogenital inf) ve U. urealyticum bu cinslerdeki en önemli patojenlerdir. BAKTERĠLERĠN YAPISI VE SINIFLANDIRMASI Bakteriler morfolojik özellikleri, üreme özellikleri, enzimatik aktiviteleri, nükleer materyal yapısı (Guanin/sitozin oranı) ,… gibi pek çok özellikleriyle sınıflandırılmıştır. Fakat günümüzde bu sınıflamada genetik bilginin önemi artmıştır.

MİKROBİYOLOJİ Günümüzde bu konuda en duyarlı test DNA-rRNA karşılaştırmasıdır. Çünkü rRNA mutasyondan en az etkilenen genetik materyaldir. Bu yöntemlerin kullanılmasıyla pek çok yeni tür ve cins ayrılmıştır. Bu amaçla araştırılan 16 s RNA , r RNA 30 S alt ünitesinde yer alan bir dizidir. SĠTOPLAZMA VE ĠÇĠNDE YER ALAN ĠNKLÜZYONLAR Sitoplazmada Golgi aygıtı, lizozom, mitokondri bulunmaz. Ribozomlar ise (70 S) sitoplazmada bulunurlar. Ribozomlarda protein sentezi gerçekleştirilir ve ökaryot ribozomlarından daha farklı yapısı nedeniyle antibiyotikler (aminoglikozid, tetrasiklin, makrolid,…) seçici olarak sadece bakteri ribozomlarını etkilemektedir. Ayrıca sitoplazmada dairesel kendi kendine çoğalabilen DNA dizileri (plazmid) ve küçük , çoğalmayan fakat diğer DNA dizilerine girebilen diziler (transpozon) de belirlenebilirler. BAKTERĠLERĠN YAPISI Yapı Kimyasal kompozisyon Fonksiyon Esansiyel komponentler Hücre duvarı Peptidoglikan Belkemiği şekerdir, yan zincir olan peptid Sert yapı sağlar. Osmotik basınca karşı korur, penisilin ve sefalosporinlerin etki çapraz bağlanmıştır alanıdır. Lizozimle yıkılır. Gram (+) bakterilerin yüzey Teichoic asit Majör yüzey antijenidir. Fakat laboratuar lifleri tanıda nadir kullanılır. Faj reseptörü Gram (-) bakterilerin dış Lipid A Endotoxinin toxic komponentidir. membranları Po lisakkarit Majör yüzey antijenidir. Laboratuar tanıda sıklıkla kullanılır. Sitoplazmik membran Lipoprotein, sterol içermez Oksidatif ve transport enzimlerinin bulun- duğu bölge Ribozom RNA, 50S ve 30S subunitelerindeki protein Protein sentezi; aminoglikozid tetrasiklin, eritromisin, kloramfenikolün etki alanıdır. Nükleosid DNA Genetik materyal Mezozom Plasma membranının invajinasyonu Hücre yapılarına ve sekresyona katılır Periplazmik aralık Dış membran ve plazma membranı arasında Bazı hidrolitik enzimler ve Beta laktamaz yer alır içerir Nonesansiyel komponentler Kapsül Polisakkarit Fagositoza karşı korur Ġki tiptir: 1-hücre yüzeyine tutunmayı sağ- Pilus ve Fimbria Glikoprotein lar. 2-sex pilus konjugasyonda iki bakterinin tutunmasını sağlar Flajel Protein Hareketi sağlar Spor Dipikolinik asit, keratin tabaka Dehidratasyon, ısı ve kimyasal maddelere karşı rezistans sağlar Plazmid DNA Toxinler ve antibiyotik rezistansı için bir tür gen içerir Granül Glikojen, lipid, polifosfatlar Sitoplazmadaki besin depolarıdır Glikokalix Polisakkarid Yüzeylere yapışmada görevli ID:

MİKROBİYOLOJİ MİKROBİK HÜCRE BİLEŞENLERİ Hücre Tipi Yapı BileĢim Mantar Gram Gram Mikoplaz- Klamidya Rickettsia Pozitif Negatif malar Bakteri Bakteri Zarf kapsül Polisakkarit veya – + veya – + veya – – – – polipeptid Duvar Kitin Poli-N-asetilgluko- + – – – – – zamin Peptidoglikan Poli-N-asetil- – + + – – + glukozamin-N asetilmuramik asit-tetrapeptidi Periplazmik aralık Proteinler ve – – + – + + oligosakkaritler Lipoprotein Lipoprotein – – + – + + Dış membran Proteinler, – – + – + + fosfolipidler ve lipopolisakkarit Ekler Protein – + veya – + veya – – – – Pili Flajel Protein – + veya – + veya – – – – Hücre membranı Proteinler ve + + + + (Sterol) + + fosfolipidler (ve ergosterol) Sitoplazma Protein, fosfoli- Organeller pidler ve nükleik + – – – – – asitler 80S Protein ve RNA + – – – – – Ribozomlar 70S Protein ve RNA – + + + + + Ribozomlar Genetik meteryal Protein, fosfoli- + – – – – – Nükleus pidler ve nükleik asitler Nükleoid Protein ve nükleik – + + + + + asitler Plazmidler DNA + veya – + veya – + veya – + veya – + veya – + veya – Spolar Tüm hücre + – – – – – Reprotüktif bileşenleri Sporlar Endosporlar Tüm hücre – + veya – – – – – bileşenleri ID :06t016 NUKLEUS Nukleus zarı ve çekirdekçik bulunmaz. Sitoplazmanın ortasında stoplazmaya belirli bölgelerden (mezozom) bağlanan , kıvrımlar halinde sıkıştırılmış olarak bulunan tek ve kapalı bir zincir halindeki DNA „dan ibaret nükleoid bulunmaktadır. DNA genelde kapalı (sirküler) bir yapıda iken bazı bakterilerde lineer olarak bulunmaktadır (LYME hastalığı etkeni Borellia burgdorferi lineer DNA taşır) .

MİKROBİYOLOJİ SİTOPLAZMİK MEMBRAN Tüm diğer canlı hücrelerde olduğu gibi iki lipid tabakası içinde (fosfolipid, fosfotidil kolin, serebrozid, trigliserid) proteinlerden oluşmaktadır. Ökaryot hücrelerden faklı olarak yapısında sterol bulunmaz (Mycoplasma cinsi hariç). Sitoplazmik membran görevleri Ģöyle özetlenebilir: • Bu bölge selektif geçirgenlik ve maddelerin transportunda kilit görev alır. Transport işlevinde permeazlar rol alır. Böylece ozmotik basıncı düzenleyerek hücreyi korur. • Hücre duvarının protein sentezi için gerekli enzimler hep burada yapılır (biyosentez) • Maddeleri parçalayan hidrolitik enzimler (beta laktamaz, Ig A proteaz,…) burada yapılır. Penisilinaz buna iyi bir örnektir; Gram (+) bakterilerde çevreye , Gram (-) bakterilerde periplazmik aralığa salınır. Ayrıca ekzotoksinlerin de sentez/salgı birimidir. • Pekçok duysal ve kemotaktik protein de sitoplazma zarı ile ilişkilidir. Kemoreseptörler de sitoplazmik membranda bulunurlar. • Bakterilerde solunum iĢlevini gören sitokromlar sitoplazma zarında bulunurlar ve bu özelliği ile sitoplazma zarı ökaryotların mitokondri iĢlevini görmektedir denilebilir . Mezozomlar ise sitoplazma zarının kıvrımlı girintileridir. Septumda (septal) ya da başka bir bölgede (lateral) oluşabilirler. Septal mezozom nükleoidin(DNA) tutunma yeridir ve bakterinin bölünmesinde rol oynar. Lateral mezozomlara plazmidler tutunabilir, spor oluşumunda ve ayrıca sekresyonda rol alırlar. Virulansla ilgileri yoktur . Hücre duvarı Bakteriyi iç basınca karşı koruyan, şeklini veren , su gibi düşük osmotik ortamlarda bakteriyi koruyan yapıdır. Gram boyanma özelliği de hücre duvar yapısındaki farklılıklardan kaynaklanmaktadır. Uygun olmayan koşullarda , lizozim ile ya da hücre duvarına etkili antibiyotiklerle karşılaştıklarında bakteriler hücre duvar yapılarını kaybederek hipertonik ortamda yaşamlarını devam ettirebilirler . Uygunsuz durum ortadan kalkınca normal hale dönebilirler . Bu bakteriler üreme ve bölünme yeteneğine sahipse L – formu bakteriler denir. Gram (-) bakteriler gibi boyanırlar, penisilinlere dirençlidirler, daha yavaş ürerler ve zar/filtrelerden süzülebilirler . Bu hale gelen bakteri Gram (+) duvar yapısındaysa protoplast ,Gram (-) hücre duvar yapısındaysa sferoplast adı verilir. Sferoplastlarda protoplastlardan farklı olarak dış membran kalıntıları bulunmaktadır. L-formu ile (özellikle endokarditlerde) kronik infeksiyonlar ve nüksler olabilir. Arkebakteriler dışında, hücre duvarı bulunan tüm bakterilerde sağlamlık , direnç ve şekili sağlayan en önemli hücre duvan tabakası, peptidoglikan (murein) katmanıdır. Mycoplazmalarda peptidoglikan bulunmaz, arkeabakterilerde ise farklı bir yapı (psödoglikan, psödomurein) bulunur. Peptidoglikan yapısının glikan bölümü N-asetil muramik asit ve N-asetil glukozamin kompleksinden ibarettir. Bu yapılar birbirlerine peptid bağları ile (beta 1-4 glikozid) bağlanmış durumdadırlar(bu bağlar lizozimin hedef bölgesidir). Aradaki tetrapeptidler arasındaki çapraz bağlar yapının dayanıklılığını sağlar.

MİKROBİYOLOJİ GR (+) HÜCRE DUVARININ KĠMYASAL YAPISI VE FONKSĠYONLARI İskelet yapı tüm bakterilerde aynıdır fakat tetrapeptid dizileri ile oluşan çapraz bağlar türden türe değişir. Tetrapeptid zincirde ilk aminoasit L-alanin, ikinci D-glutamik asittir. Üçüncü aminoasit Gram (-) bakterilerde diaminopimelik asittir. Gram(+) bakterilerde diaminopimelik asit ya da lizin (nadiren ornitin )olabilir. Dördüncü aminoasit D-alanindir. D-alanin tetrapeptidler arası çapraz bağlanmayı sağlar. Diaminopimelik asit Gram (-) bakterilerde lipoprotein tabakayı bağlar ve sadece prokaryot hücre duvarında bulunur . Uçtaki iki D-Ala vankomisin ve teikoplanin in başlıca etki bölgesidir.Transpeptidasyon eylemi; transpeptidaz, endopeptid, karboksipeptidazlarca yerine getirilir. Bu enzimler Beta-laktamlı antibiyotiklerin ana hedefidirler ve Penisilin bağlayan proteinler (PBP) adı verilir. Beta laktamlar moleküler benzerlik ile etki gösterirler. Penisilin ve sefalosporinlerin moleküler yapısı pentapeptidlerin terminalindeki D-Ala-D-Ala ile benzerlik gösterir. Transpeptidaz enziminin aktif bölgesine irrreversibl olarak bağlanarak D-Ala D-Ala ile kompleks oluşturmasını önlerler. Peptidoglikan sentezini 3. ve son aşamada engellerler. Penisilinlerin genelde bağlanma yeri PBP 1 ve 3‟tür. Ayrıca penisilinler bazı bakterilerde doğal olarak bulunan ve mureini hidrolize eden bakteriyel otolizinlerin inhibitörlerini bloke ederek te etklli olabilirler. Gram (+)‟lerde hücre duvarı kuru ağırlığının %50‟sini (%40-80), Gram (-)‟lerde ise %5-10‟unu peptidoglikan tabaka oluşturur; Gram (+)‟lerde hücre duvarı daha sağlam ve kalındır. Peptidoglikan, memelilerin idrar ve beyin omurilik sıvısı (BOS) hariç tüm salgılarındaki nonspesifik bağışık yanıt elemanlarından olan ve fagositozla

MİKROBİYOLOJİ bakteri öldürülmesinde büyük önemi olan lizozim enziminin (Muramidaz) hedefidir. Peptidoglikan miktarı Gram(+) bakterilerde daha fazla olduğundan lizozime daha duyarlıdırlar. Gram (+)‟lerde Lipoteikoik/teikoik ve bir miktar teikuronik asid, peptidoglikan tabaka içinde dağınık halde bulunur. Bu yapılar ribitol ve gliserolden oluşurlar. LĠpoteikoik asit, Gram (+)’lerin majör yüzeyel antijenik determinantı ve yapıĢma elemanıdır ve Gram (-)’lerde bulunmaz. Teikoik asit bakteriyi lizozimin etkisinden de korumaktadır. Ayrıca teikoik asitler Gram (+) bakterilerin fajları için reseptörleri de taĢırlar . Bazı Gram (+) bakterilerde polisakkarid tabaka (streptokokların C karbonhidratı) , dış protein (S pyogenes M proteini) ya da Mycobacterium cinsindeki bakteriler gibi glikolipidler bulunabilir. Hatta Listeria monocytogenes‟in hücre duvarında lipopolisakkarid elemanlar da bulunmaktadır. Gram(-)‟lerin hücre duvarının en dışında fosfolipid (FL) ve lipopolisakkaridden(LPS) oluşan bir dıĢ tabaka(dıĢ membran) bulunur. Dış membran ile sitoplazma arasındaki boşluğa periplazmik aralık denilmektedir. Dış membran altında peptidoglikan ile dış membranı birbirine bağlayan lipoprotein tabaka bulunur. Dış membranda bazı proteinler(porin, integral proteinler) de bulunur ve hidrofobik yapıları dışarı atabilme yeteneğine sahiptir. Böylece hücreyi dıĢ ortamın safra tuzu ve hidrolitik enzimlerinden korur . Dış membrandaki porinler, şeker, aminoasit, vitamin, gibi zorunlu maddeleri ve antibiyotiklerin hücre içine girişine izin vermektedir. Bazı büyük moleküllü antibiyotiklerin geçişi bu porinlerdeki defektler sayesinde engellenebilir ve direnç gelişebilir. Pseudomonas aeruginosa‟daki birçok antibiyotiğe karşı direnç bu şekilde olabilmektedir. Omp A dış membrandaki en büyük protein olarak göze çarpar ve dış membranı peptidoglikan tabakaya bağlar. Bazı büyük moleküllü antibiyotiklerin (vankomisin) geçişi bu porinlerdeki defektler sayesinde engellenebilir ve direnç gelişebilir. Porin değiĢikliği ile karbapenem gibi küçük moleküllü ab‟lerin girişi engellenebilir. DıĢ membran proteinleri aynı zamanda fajlar, bakteriyosinler ve piluslar için reseptör görevi de görürler. Dış membranın en yüzeyinde lipopolisakkarid tabakası (LPS) yer alır ve LPS tabakasında üç katman izlenir: a) Lipid A: Uzun zincirli yağ asitleri + glikozamin disakkarit üniteleri ( daima beta- hidroksi miristik asit bulunur). LPS tabakanın endotoksin etkisinin tümünden bu bölüm sorumludur. b) Kor: Tüm Gram(-) ortak polisakkarid yapı. Lipid-A ile ketodeoksioktülonatla bağlıdır. c) Polisakkarid : Türe özgül O antijeni (somatik antijen). Bazı Gram(-) bakterilerde dış membran LPS yoktur, bunlarda glikan yapısında çok sayıda çıkıntılar bulunur (Lipooligosakkarid:LOS) . Bu mekanizma ile konak yapısına benzerlik göstererek savunma sisteminden kaçabilirler ( Örneğin gonokok, meningokok, H influenzae, H ducreyi,..).

Mikrobiyoloji Laboratuarı

MİKROBİYOLOJİ LABORATUARI

Laboratuar Malzemeleri :

Buzdolabı : Besiyerlerinin ve hazırlanan petrilerin bozulmasını önlemek için kullanılır.

Etüv : Mikrobiyal gelişime gözlenebilmesi için uygun sıcaklık sağlar.

Mikrodalga Fırın : Besiyerlerinin sterilizasyonundan önce agarları eritmek amacıyla kullanılır.

Su Banyosu : Hazırlanan donmuş besiyerlerinin eritilmesi için kullanılır.

Otoklav : Besiyeri ile çözeltileri sterilize etmek ve yıkama öncesi kirli malzemeyi sterilize etmek için kullanılır. Sterilize edilecek malzeme otoklav iç çeperlerine değmeyecek ve hava akımına izin verecek şekilde doldurulmalıdır.

Stomacher : Çözelti eklenen numunelerin parçalanmasını ve homojenizasyonunu sağlayan alettir.

Vorteks : Deney tüplerinin tam olarak kolayca karıştırılmasını sağlar.

Isıtıcılı Manyetik Karıştırıcı : Karıştırma hızı ayarlanabilen termostatlı bir cihazdır.

Ph metre : Asitliği ölçme amaçlı kullanılan laboratuar aletidir.

Membran Filtrasyon Cihazı : Su tayininde kullanılan laboratuar aletidir.

Hassas Terazi : Numunelerin ve besiyerlerinin tartılmasında kullanılır.

Mikroskop : Görülemeyecek kadar küçük cisimleri mercek yardımıyla büyütüp görülmesini sağlayan alettir.

Eliza Cihazı : Et karışımları için tür tayinde kullanılan laboratuar aletidir.

Pipetör : Deney tüplerinde hazırlanan besiyerlerinin veya çözeltilerin istenen miktarda aktarılmasını sağlar.

Koloni Sayacı : Petrilerde üreyen mikroorganizmaların kolonilerinin sayımı için kullanılan alettir.

Laboratuar Bölümleri :

Besiyeri Tartım Odası : Bu bölümde dehidre besiyerlerinin tartılması ve saf su ile ıslatılması gerçekleştirilir. Hava akımının olmadığı bir odadır. Odanın steril kalmasına dikkat edilmektedir.

Numune Alım Bölümü : Firmalardan steril ortamlarda alınmış olan ürünlerden mikrobiyolojik analiz yapılmak için belirli miktarlarda örnek alınır ve çözelti hazırlanır. Stomacher yardımıyla çözeltinin homojenizyonu sağlanır.

Ekim Odası : Alınan numuneler firmanın isteğine göre belirli analizleri yapmak üzere belirli besiyerlerine ekim yapılır.

Steril Kabin : İlk ekimden ya da ön zenginleştirmeden sonra geçişler bu bölümde yapılır.

Su Analiz Bölümü : Firmaların isteğine göre suyun analiz edildiği bölümdür.

Değerlendirme Odası : Mikroorganizmaların sayılıp, hesaplamaların yapıldığı bölümdür. Aynı zamanda etüv odasıdır.

Yıkama ve Sterilizasyon Bölümü: Bu bölümde bulaşık ve çamaşır makinesi, iki kurutma dolabı, iki otoklav, su distile cihazı bulunmaktadır. Laboratuardan çıkan kullanılmış petriler, kavanozlar, numuneler sterilize edildikten sonra atık toplama ekibine teslim edilir. Su distile cihazı ile saf su üretimi gerçekleştirilir.

Numune Alımı :

Su Numunesi Alımı :  Denetime gidilen işletmede önce klor tayini için tüpe su alınır ve 4-5 damla ortotoudin damlatılıp çalkalanır. Eğer  numunede klor varsa sarı rengi alır. Son renk skaladan bakılarak su içerisindeki klor miktarı ppm olarak belirlenir. Klor tayininden sonra numune almak için bek alevi yakılır. Alevin yanında alkol ile steril edilmiş musluktan steril şişeye numune alınır. Şişenin üzerine işletme adı ve tarih not düşülür.

Hava Kontrolü : İşletmelerdeki havanın kontrolü için air sampler denen cihazla numune alınır. Cihaz çeşitli, hacme göre ayarlanabilmektedir. Cihaz çalışırken ortamda kimse bulunmamalı ve kapılar kapalı olmalıdır. Sterile edilmiş cihaz kapağının altına PCA ve DRBC agarın bulunduğu petri kaplarına işletme adı ve tarih not düşülür. PCA besiyeri 37 C de 24 saat, DRBC 25 C ‘de 5 gün süreyle inkübasyona bırakılır.

Son Ürün Numunesi Alımı : Denetlenen işletmenin ürettiği bir ürün numune alınarak, bozulmaması için soğuk zincirde laboratuara taşınır. Bu işlem sırasında kesinlikle işletmelerin ekipmanları kullanılmaz ve steril kaşık, kavanoz ve bıçak kullanılır. Alınacak numune bek alevi yanında steril kavanozlara alınır. Kavanoz üzerine işletme adı, tarih not düşülür.

Girdi Numunesi Alımı : İşletmelerde üretimde kullanılacak maddelerden numune alınarak analiz yapılması istenebilir. İşletmeler hangi hammaddenin denetlenmesini istiyorsa ondan  numune alınır. Analiz yapılacak hammadde küçük paketlerdeyse paket ile, büyük paketlerde ise bek alevi yanında numune alımı yapılır. Kavanoz üzerine işletme adı, tarih not düşülür.

Swap Testi : İşletmelerde personel hijyen swap testi ve ekipman hijyen swap testi isteğe göre uygulanır. Swap tüpten çıkarılır, temizliği kontrol edilecek yüzeye sürülür. Daha sonra swap tekrar tüpe yerleştirilir. Tüp üzerine işletme adı, personel yada ekipman adı, tarih not düşülür.

Sıcaklık ve nem kontrolü : Denetimler sırasında üretim alanının sıcaklık ve nem ölçümü hassas kollu bir cihazla yapılmaktadır. Kesin ölçüm için ölçüm yapılan alanda bu hassas kollar saklanır. Her yerden ölçümler alınarak son ortalama değer hesaplanır ve değerler raporla birlikte işletmeye sunulur.

Besiyerleri

            Hafta başlarında gerekli besiyerleri ihtiyaca göre hazırlanır. Eksilmesi durumunda ihtiyaç olan besiyerleri takviye edilebilir.

Besiyerinin Hazırlanması :

  Laboratuarlarda kullanılan besiyeri, dehidre formdan hazırlanır. Her besiyeri kutusunda, kataloğunda ya da prospektüsünde, o besiyerinin nasıl hazırlanması gerektiği yazmaktadır.

  Bu amaçla, gereken miktar dehidre besiyeri tartılıp, üzerine saf su eklenir.

  Tartım besiyerlerinin saklanacağı 250ml, 500ml ve 1000 ml’ lik sterilize edilmiş schot şişelerine yapılır. Kullanılan spatül sterilize edilmiş olmalıdır.

  Tartım sonrasında terazi dezenfektan ile silinerek temizlenmelidir.

  Besiyerine ilave edilecek su sterilize edilmiş dereceli mezür ile ölçülür. Ölçülecek suyun hacmi ile mezürün hacmi birbirine yakın olmalıdır.

  Ölçülen saf su tartım yapılmış schotlara eklenir ve çalkalanarak besiyerinin erimesi sağlanır.

  Bazı besiyerleri soğuk suda elle hafifçe bir çalkalama sonunda tümüyle eriyebilir. Bazı besiyerleri ise eritilmeleri için mutlaka ısıtılmalarına gerek vardır. Agarlı besiyerleri, önce agarın erimesini sağlayacak şekilde ısıtılmalıdır. Bunun için mikrodalga fırın kullanılır.

   Mikrodalga fırın ani ısınmalara ve kaynamalara neden olacağı için dikkatli kullanılması gerekir. Özellikle düşük miktarda agar içeren besiyerleri eritme sırasında aniden kaynayarak kaptan taşabilir.

  Besiyerinin kaynadığının görülmesi, agarın eridiği anlamına gelmez. Bu nedenle mikrodalga fırın kullanılarak eritme yapıldığında, erlen veya schot iç çeperinde agar ya da diğer besiyeri partiküllerinin kalmadığından emin olunmalıdır. Partiküller gözlenirse yeniden karıştırılmalı ve tekrar mikrodalga fırına konulmalıdır.

  Otoklavlama öncesi ısıtarak eritme dikkatli yapılması gereken bir iştir. Sürekli karıştırılarak yapılmalıdır. Aksi halde tam erimemiş partiküllerin yanmasına neden olunabilir. Besiyeri hafifçe çalkalandığında iç çeperde partikül kalmaması erimenin tam olarak gerçekleştiğini gösterir.

  Hazırlanan erimiş besiyerleri otoklavda sterilize edilir.

  Sterilize edilen besiyerleri soğutulduktan sonra bozulmaması için buzdolabında saklanır.

  Saklanan besiyerleri ihtiyaç olduğunda su banyosunda eritildikten sonra petrilere dökülür.

Besiyerinin Depolanması :

  Dehidre besiyerleri higroskopik (nem çekici) özelliktedir. Dolayısı ile ağzının sıkı bir şekilde kapatılmış olarak kuru yerlerde depolanması gerekir.

  Besiyeri kutusu ilk açıldığında üzerine açım tarihi yazılmalı ve hiçbir koşulda aynı besiyeri çeşidinden aynı anda birden fazla kutu açılmamalıdır.

  Besiyerleri hazırlandıktan sonra sterilize edilir ve daha sonra kullanmak üzere buzdolabında depolanır. Bazı besiyerlerinin hazırlandığı gün kullanılma zorunluluğu vardır.

  Hazırlanmış besiyerlerinde nem kaybından kaçınmak gerekir.

  Besiyerleri petri kutusuna döküldükten sonra depolanmak isteniyorsa; kutuların üzerine döküldüğü tarih not edilerek en çok 10 gün içinde kullanılmak üzere buzdolabında depolanabilir.

  Petri kutularının mutfak tipi strech film ile sarılarak depolanması  raf ömrünü uzatan bir uygulamadır.

  Hazırlanmış besiyerleri elden geldiği ölçüde serin ortamlarda tutulmalıdır. Ancak, özellikle agarlı besiyerlerinin dondurulmasından kesinlikle kaçınılması gerekir. Dondurma, agarın jelleşme özelliğine önemli ölçüde zarar verir.

Katkıların Eklenmesi :

  Çeşitli antibiyotikler, vitaminler, kan ve yumurta sarısı başta olmak üzere besiyeri bileşimine giren bazı maddeler otoklavlama sırasında tahrip olur ya da yüksek sıcaklıkta bileşimdeki maddeler birbirleri ile reaksiyona girer. Bu gibi maddeler otoklav sonrasında bazal besiyerine ilave edilir.

  Katkı ilave edilmiş agarlı besiyeri hızla Petri kutularına dökülmelidir. Aksi halde katkı yüksek sıcaklıktan olumsuz etkilenir ve sahte negatif sonuçlar alınabilir.

  Katkıdan steril koşullara uyularak gereken miktarın alınmasından sonra yine steril koşullara uyularak ağzının kapanmasına özen gösterilmelidir.

  Aksine bir uyarı yoksa besiyeri katkıları 2–8 oC’da depolanır.

Petri Kutularına Döküm :

  Otoklav sonrası agarlı besiyerleri uygun sıcaklığa geldiğinde Petri kutularına dökülerek kullanılır. Ya da buzdolabında saklanan agarlı besiyerleri su banyosunda eritildikten sonra uygun sıcaklığa geldiğinde Petri kutularına dökülerek kullanılır.

   Besiyeri dökülmeden önce, homojenliğinden emin olmak için çalkalanmalıdır.

  Besiyerinin yaklaşık 45 oC’a soğutulması ve bu sıcaklıkta Petri kutularına dökülmesi gerekir.

  Yüksek sıcaklıklarda dökme, Petri kutusunun kapağı içinde aşırı su yoğunlaşmasına yol açar. #

  Eğer Petri kutusunda “dökme plak yöntemi ile kültürel sayım” yapma amacıyla önceden ilave edilmiş örnek varsa dökme sıcaklığı 40 oC’ı geçmemelidir.

  Agarlı besiyeri döküldükten sonra kalınlığın “en az 2–3 mm” olması önerilmektedir.

  Besiyeri döküldükten sonra Petri kutuları yatay bir zeminde soğumaya ve katılaşmaya bırakılır.

Swap Analizi

            Firmalardan uygun koşullarda alınmış swaplardan, daha önceden hazırlanmış olan ikili petrilere geçiş yapılır. Swap analizi ile firmanın isteğine göre;

  S. aureus – Koliform için Baird Parker Agar – Violet Red Bile Agara

  S. aureus – Toplam canlı için Baird Parker Agar – Plate Count Agara

  Toplam canlı – Koliform için Plate Count Agar – Violet Red Bile Agara

  Küf ve Maya için Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agara

geçiş yapılır. Ekim sonunda üzerlerine tarih ve swap numarası yazılmış petriler inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda ise değerlendirilir.

Membran Filtrasyon ile Suda Analiz

            Membran filtrasyon sistemi özellikle içme suyu ve berrak meyve suları gibi filtrasyonda sorun çıkarmayan ve çok az sayıda mikroorganizma bulunabilen örnekler için idealdir. Laboratuarda E.coli, Koliform, Enterekok ve toplam canlı analizi için membran filtrasyon kullanılıyor. Analiz yapılacak numune; içerdiği mikroorganizmaların büyüklüğünden daha küçük gözeneğe sahip membran filtre ile vakum yardımıyla süzülür.Mikroorganizmaların üzerinde kaldığı membran  petri kaplarına alınıp inkübe edilir. Analiz yaparken izlenecek yol ;

  Hazır besiyeri içeren petriler çıkarılır. Petri kapaklarına gerekli olan bilgiler yazılarak petriler hazır hale getirilir.

  3,5 ml ayarlı olan dozaj şırıngasının filtresi bek alevi yanında el değmeden  değiştirilir. Ardından kullanılacak olan saf su yine steril olarak değiştirilir.

  Çıkarılan  hazır besiyerlerine dozaj şırıngası ile 3.5 ml saf su ilave edilir.

  Filtre desteği bek alevi yardımıyla sterilize edilir .

  Steril paketlerdeki membran filtre alev yanında el değmeden açılır.

  Pens alevden geçilip sterilize edildikten sonra membran pens ile alınıp filtre desteğine yerleştirilir.

  Isıtılan destekteki membranın koruyucu tabakası pens ile alınır.

  Huni alevden geçirilip desteğe yerleştirilir.

  Huni kapağı açılarak alev yanında numune 100ml eklenir.

  Vakum pompası ile su membrandan geçirilir.

  Filtrasyon işleminden sonra vakum kapatılır.

  Filtre pens ile alınıp steril su ile ıslatılmış olan besi ortamı üzerine yerleştirilir.

  Besiyerleri inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon sonunda koloniler sayılıp rapor edilir.

Mikrobiyolojik Analizler

            Mikrobiyoloji Laboratuarında Tarım ve Köyişleri Bakanlığı İl Müdürlüğü tarafından gönderilen Türk Gıda Kodeksindeki uygulamalara göre analiz yapılmaktadır.

            Öncelikle, laboratuar tarafından analize alınmak üzere numune kabul edilmelidir. Bu kabul için laboratuar personeli, numunenin laboratuara gereken koşullarda getirilip getirilmediğini kontrol eder. Eğer standart koşullarda getirildiğine emin olunursa, numune analiz için kabul edilir. Aksi halde ya numune kabul edilmez ya da kabul formuna bununla ilgili tüm olumsuzluklar yazılır.

            Laboratuara gelen ve kabul edilen örnek için, kabul tarihi, kabul saati, ürün ile ilgili tüm bilgiler (üretim tarihi, ambalaj özellikleri, parti numarası, vardiya numarası, numunenin alındığı saat, gerekli ise örnek alım sıcaklığı, laboratuara giriş sıcaklığı vb.) kayda alınır.

            Analiz için gelen örnek mümkün olan en kısa süre içinde analize alınmalıdır. Analiz için bir süre beklemek zorunluluğu varsa;

– Mikrobiyolojik olarak stabil olan ürünler son kullanma tarihinden önce ve elden geldiği kadar çabuk olarak analize alınmalıdır.

– Taze ve soğutulmuş ürünler kabulden sonra 24 saat içinde analize alınmalıdır.

– Dondurulmuş ürünler +4 oC buzdolabı sıcaklığında çözündürülmelidir. Dondurulmuş ürün analiz amacıyla çözündürüldü ise analiz ertelenemez.

            Laboratuara gelen ve kabul edilen numunenin paraleli analiz bitinceye kadar ürün özellikleri değişmeyecek şekilde şahit olarak korunur.

            Ürünlerden belirli bir ağırlığın (10 g, 25 g vb.) tartılarak analiz için numune alınması aseptik koşullar altında yapılır.

            Laboratuarda incelenen numuneler raporların işletmeye gönderilip, işletmeden onay gelene kadar soğuk ortamda saklanır.

            Yapılan deneylerde kullanılan malzemelerin hata oluşturmasını önlemek için , kullanılan malzemelerden de ekim yapılır.

            Seyreltme işlemi bitirildikten sonra hızla ekim yapılır.

            Petri kutularının ekime başlamadan önce yazılmış olması işlem sırasında gereksiz beklemelerin ve karışıklıkların önüne geçer.

            Ekim yapılan petriler etüvlere ters olarak yerleştirilir. Sadece DRBC ve su analizinde kullanılan petriler etüvlere düz olarak yerleştirilir. Ayrıca DRBC’ler mutfak tipi streç film ile sarılarak etüvlere konmaktadır.

Staphylococcus aureus Analizi :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  Staphylococcus aureus analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.

  BPA (Baird Parker Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.

  Drigalski spatülü yardımıyla numune BPA besiyerine yayılır.

  Petriler ters olarak 35 oC de 48 saat inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon  sonunda Staphylococcus aureus yuvarlak, 1 – 1.5 mm çapında, düzgün  kenarlı ,etrafında şeffaf bir zon bulunan siyah koloniler meydana getirir.

  Şüpheli bulunan siyah, zonlu kolonilere koagülaz testi yapılır.

  Koagülaz (+) özellik gösteren koloniler sayılır.

Bacillus cereus Analizi :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  Bacillus cereus analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.

  MYP (Mannitol-Egg-yolk-Polymyxine Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.

  Drigalski spatülü yardımıyla numune MYP besiyerine yayılır.

  Petriler ters olarak 30 oC de 48 saat inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon  sonunda Bacillus cereus pembe-mor renkli, etrafında opak çerçeve olan basık yüzeyli koloniler meydana getirir.

  Bu kolonilerin Bacillus cereus olduğunu doğrulamak için saflaştırma yapılarak biyokimyasal test uygulanır (API Testi).

Clostridium perfringens Analizi :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  Clostridium perfringens analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.

  TSC (Tryptose Sulfite Cycloserine Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.

  Drigalski spatülü yardımıyla numune TSC besiyerine yayılır.

  Daha sonra üzerine uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş TSC dökülür.

  Clostridium perfringens anaerobik bir bakteri olduğundan petriler genbag lere konularak  35 oC de 24 saat inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon  sonunda Clostridium perfringens siyah renkli koloniler meydana getirir.

  Bu kolonilerin Clostridium perfringens olduğunu doğrulamak için saflaştırma yapılarak biyokimyasal test uygulanır (API Testi).

Küf – Maya Analizi :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  Küf – Maya analizinde yayma plak yöntemi kullanılır.

  DRBC (Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar) dökülerek hazırlanmış; üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış petrilere 0.5’er ml numune konulur.

  Drigalski spatülü yardımıyla numune DRBC besiyerine yayılır.

  Petriler streç film ile sarıldıktan sonra ters çevrilmeden 25 oC de 5 gün inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon  sonunda küfler ve mayalar ayrı ayrı sayılır.

  Sayımlarda 10-150 arasındaki petriler dikkate alınır.

Enterobacteriaceae Analizi :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  Enterobacteriaceae analizinde dökme plak yöntemi kullanılır.

  Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.

  Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş VRBGA (Violet Red Bile Glucose Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.

  Petriler 35 oC ‘de 24 saat inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon  sonunda Enterobacteriaceae pembe renkli koloniler meydana getirir.

  Şüpheli bulunan pembe koloniler saflaştır ve oksidaz testi yapılır.

  Oksidaze (-) özellik gösteren koloniler sayılır.

Koliform Analizi (kob/g) :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  Koliform analizinde dökme plak yöntemi kullanılır.

  Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.

  Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş VRB (Violet Red Bile Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.

  Petriler 35 oC ‘de 24 saat inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon  sonunda koliform bakteriler; pembe renkli ve zonlu koloniler meydana getirir.

E. coli Analizi (kob/g) :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  E. coli analizinde dökme plak yöntemi kullanılır.

  Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.

  Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş TBX (Tryptone Bile X glucoronide Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.

  Petriler 44 oC ‘de 24 saat inkübasyona bırakılır.

  İnkübasyon  sonunda bakteriler; yeşil renkli koloniler meydana getirir.

  Bu kolonilerin E. coli olduğunu doğrulamak için saflaştırma yapılarak biyokimyasal test uygulanır.

Aerobik Koloni Sayımı 35 oC :

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Türk Gıda Kodeksi göz önünde bulundurularak ürünün cinsine ve firmanın isteğine göre dilüsyonlar (10-2, 10-3, 10-4, …) çoğaltılabilir.

  Aerobik koloni sayımında dökme plak yöntemi kullanılır.

  Çözeltiler, üzerinde numune numarası, dilüsyon numarası ve tarih yazılmış boş petrilere 1’er ml olarak konulur.

  Uygun sıcaklığa gelmiş olan eritilmiş PCA (Plate Count Agar) petri kutularına dökülüp; petri kapağına besiyeri bulaşmamasına dikkat edilerek karıştırılır ve homojenize edilir.

  Petriler 35 oC ‘de 48 saat inkübasyona bırakılır.

  Oluşan bütün kolonilerin sayımı yapılır. Koloni sayısı 25-250 arasında ise sayım yapılır; fazla ise sayılamayacak kadar çok olarak değerlendirilir.

MPN Tekniği ile Koliform Bakteri ve E. Coli Analizi

  Steril numune poşetine 10 g numune steril aletler kullanılarak bek alevi yanında tartılır. Tartım yapılırken üründen homojen bir şekilde örnek alınmasına dikkat edilir.

  90 ml Maximum Recovery Diluent tartılan numuneye eklenir.

  Stomacher ile karıştırılır. Oluşan karışım 10-1 lik dilüsyondur.

  Hazırlana çözeltiden 9 ml LST bulunan durham tüplü üç tüpe ekim yapılır.

  9 ml Maximum Recovery Diluent içeren tüpe 1 ml 10-1dilüsyon konularak 10-2 dilusyon elde edilir.

  10-2 dilüsyondan 9 ml LST bulunan durham tüplü üç tüpe ekim yapılır.

  Aynı işlemlerle 10-3 dilüsyon elde edilir ve 3 tüpe ekim yapılır.

  Böylelikle MPN tekniği uygulanmış olur.

  Tüpler Koliform tespiti için 37oC de 48 saat inkübe edilir.

  Bu süre sonunda  gaz oluşan tüplerden bir öze ile 9 ml Brillant Green Bile Broth bulunan tüplere ekim yapılır.

  Tüpler 44oC de 24-48 saat inkübe edilir.

  Gaz oluşumu gösteren tüpler (+) olarak değerlendirilir.

Koliform Bakteri :

  Pozitif olan LST tüplerinden 10 ml Brillant Green Laktoz Broth (durham tüplü) içeren tüplere öze ile geçiş yapılır .

  35oC de 48 saat inkübe edilir.

  Gaz oluşumu gözlenen tüpler (+) olarak değerlendirilir ve EMS tablosuna göre sonuç belirlenir.

Fekal Koliform :

  Pozitif olan LST tüplerinden 10 ml EC Broth (durham tüplü) içeren tüplere öze ile geçiş yapılır.

  44oC de 48 saat inkübe edilir.

  Gaz oluşumu gözlenen tüpler (+) olarak  değerlendirilir ve EMS tablosuna göre sonuç belirlenir.

E.coli :

  Fekal Koliform testinde gaz oluşan EC Broth tüplerinden EMB agar petrilerine geçiş yapılır.

  35oC de 24±2 saat inkübe edilir.

  Eğer metalik yeşil renkli koloniler oluşmuşsa E. coli kolonilerinden  identifikasyon için tek koloni alınarak Nutrient agara geçilerek 35oCde 24±2 saat inkubasyonla zenginleştirme yapılır.

  Bu zenginleştirilen kolonilere IMVIC testi uygulanır.

  IMVIC testi indol, metil red, voges proskauer, ve cimon citrate testlerinden oluşur.

  Hızlandırmak amacıyla son basamak olan cimon citrate yapılır.

  Metalik yeşil renkli kolonilerden cimon citrate besiyerine ekim yapılır.

  37oC’ de 24 saat inkube edilir.

  Eğer besiyeri rengi maviye dönmüşse koloniler E.coli değildir.

Salmonella Analizi :

  Steril bir kavanoza 25 gr numune tartılır.

  Üzerine 225 ml Buffered pepton ilave edilir . 35oC ya da 37±1oC de 18±2 saat inkübe edilir. Bu ön zenginleştirme aşamasıdır.

  Bu süre sonunda hazır olarak alınan MKTT tüpüne 1 ml, RVSye de 0,1 ml ilave edilir.

  MKTT besiyeri 24 saat 37oC de, RVS 24 saat 41,5oC de inkube edilir. (Selektif sıvı besiyerinde zenginleştirme)

  Bu süre sonunda katı besi yerleri olan XLD ve HE agarlara geçilip 37oC de 24 saat inkube edilir.(Selektif katı besiyerlerinde zenginleştirme)

  HE de koloniler siyah merkezli mavi yeşil renkte gözlenir, XLD agarda ise merkezleri siyah pembe olan koloniler gözlenir.

  XLD ve HE de üremiş olan koloniler Nuutrient agara tek geçilerek 24 saat 37oC de inkübe edilir.

   Zenginleştirilen kolonilerden tek düşen Salmonella spp. İçin tipik koloniden 1 tanesi aseptik koşullarda alınarak api 20 E hazır biyokimyasal test kitine de geçilebilir.

  18-24 saat inkübe edilir . Sonuç bilgisayar ortamında değerlendirilir.

Salmonella (Hızlı Test) Analizi :

  Steril bir kavanoza 25 gr numune tartılır.

  Üzerine 225 ml pepton ilave edilir. 37oC de 18 inkübe edilir. Bu ön zenginleştirme aşamasıdır.

  Bu süre sonunda rapid test kiti hazırlanır.(Oxoid)

  Bu kitte A ve B diye adlandırılan iki tüp bulunmaktadır. Dış kabın üzerinde üç farklı çizgi bulunmaktadır.

  Birinci çizgiye kadar saf su ilave edilir.

  Tüp içinden üçüncü çizgiye kadar su çekilir. Vortekste karıştırılıp 5 dk beklenir.

  İkinci çizgiye kadar Rapid Elective Medium  solusyon ve novobiocin diski eklenir.

  Hazırlanan kite 1’er ml numune konur.

  Tüplerin kapakları açılıp 44±1oC de 24 saat inkübasyona bırakılır.

  A tüpünde siyahlaşma oluşması pozitif, B tüpünde siyah ya da kırmızı renk oluşması sonucun pozitif olduğunu  gösterir.

Listeria monocytogenes Analizi :

  Süt ve süt ürünlerinde 25 gr alınarak 225 ml BLEB ile homojenize edilir.

  4 saat 30oC de inkübasyona bırakılır.

  0,9 ml supplement eklenir ve zenginleştirme yapılır.

  30oC de 44 saat inkübasyona bırakılır.

   Oxford ve Palcam agarlara öze ile ekim yapılır.

  35oC de 24 -48 saat, petriler inkübasyona bırakılır.

  Oxford agarda etrafında kahverengi veya siyah zon bulunan ortası çukur koloniler şüphelidir.

  Palcam agarda yeşil veya siyah renkli etrafında zon bulunan koloniler şüphelidir.

ü  Bunlar TSAYE besiyerine geçilip 24 saat sonra biyokimyasal teste tabi tutulur.

E.coli O157:H7 Analizi :

  Gıda numunesinden 25 g alınarak 225 ml (10-1) cefixime (0,05 mg /l.), cefsulidin (10 mg/l.) ve vancomycin (8mg/l.) içeren % 1 ‘lik Buffered Peptone Water ile homojenize edilerek 37oC de 24 saat inkübe edilir.

  İnkübasyon sonrası CT_SMAC besiyerine ekim yapılır.

  37oC de 24 saat inkübe edilir.

  CT-SMAC Agar’da E.coli O157:H7 suşları sorbitolu fermente etmez ve renksiz koloni oluştururken diğer E.coli suşları sorbitolu fermente etmez ve renkli koloniler oluştururlar.

  Sonrasında koagülaz test uygulanır.

Rope sporu Analizi :

  11 gr numune alınarak 99 ml distile su eklenir.

  5 dk’ da bir çalkalanarak 20 dk kaynar su banyosunda bekletilir.

  1 ml alınıp steril ringer çözeltisine aktarılır.

  DTB besiyerine üçlü tüp yöntemi ile 1 ml ekim yapılır.

  32oC’ de 72 saat inkübasyona bırakılır.

  MNP tablosuna göre değerlendirilir.

KİMYASAL ANALİZ LABORATUARI

Yapılan bazı analizler :

Toplam Aflatoksin Analizi :

Bebek Ve Çocuk Ek Besinlerinde ;

1.      Analiz numunesi iyice homojenize edildikten sonra, 500 ml’lik bir erlene 50 g numune tartılırve 5 g sodyum klorür tartılır. Üzerine  250 ml metanol:su (80:20) çözeltisinden ilave edilir. Erlenin kapağı kapatılır ve önce elle hızlı bir şekilde 15-30 sn çalkalanır sonra karıştırıcıda 3 dk karıştırılır.

2.      Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 20 ml başka bir kaba alınır, üzerine 20 ml saf su veya PBS ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyretilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 20 ml’ si (20 ml 2 g numuneye eş değerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1- 2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.

3.      Daha sonra immunafinite kolonu 10ml’ lik  porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.

4.      Daha sonra kolondan 1 damla/sn hızla 1ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır. Kolondan 1 damla/sn hızla 1ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

5.      Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir ml’ si 1 g numuneye eşdeğerdir.

Baharatlar, Kurutulmuş Otlar Ve Bitkisel Çaylarda ;

1.      Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 10 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 200 ml metanol:su (80:20) veya bitkisel çaylar için ise 200 ml asetonitril-su (60:40) çözeltisinden ilave edilir. Blenderin kapağı kapatılır ve yüksek devirde 3 dk karıştırılır.

2.      Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 5ml başka bir kaba alınır, üzerine 20 ml %10’luk Tween 20 çözeltisinden ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 10 ml’si (10 ml 0,5 g numunete eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.

3.      Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’ lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.

4.      Daha sonra kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti bir vialde toplanır. Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

5.      Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir milimetresi 0,25 g numuneye eşdeğerdir.

Kuruyemiş – Yağlı Tohum ;

1.      Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 10 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 250 ml metanol:su (70:30) çözeltisinden ilave edilir. Blenderın kapağı kapatılır ve yüksek devirde 3 dk karıştırılır.

2.      Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 15 ml başka bir kaba alınır, üzerine 30 ml saf su ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrat filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 30 ml’si (30ml; 2 g numuneye eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.

3.      Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır,saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.

4.      Daha sonra kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

Tahıllar Ve Tahıl Ürünlerinde ;

1.      Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 5 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 100 ml metanol:su (80:20) çözeltisinden ilave edilir. Blenderın kapağı kapatılır ve yüksek devirde 1 dk karıştırılır.

2.      Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 10 ml başka bir kaba alınır, üzerine 40 ml saf su ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 10 ml’si (10 ml ; 1g numuneye eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.

3.      Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.

4.      Daha sonra kolondan1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

5.      Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

6.      Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir milimetresi  1 g numuneye eşdeğerdir.

Kırmızıbiber ve Ürünlerinde ;

1.      Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 50 g numune tartılır ve 10 g sodyum klorür tartılır. Üzerine 200 ml metanol: su (80: 20) çözeltisinden ilave edilir. Blenderın kapağı kapatılır ve yüksek devirde 1 dk karıştırılır.

2.      Blenderdaki içerik filtre kağıdından bir erlene süzülür. Erlen içindeki süzüntüden 10 ml başka bir kaba alınır, üzerine 40 ml saf su ilave edilir ve iyice karıştırılır. Seyreltilmiş bu ekstrakt filtreden geçirilir. Filtreden geçirilmiş çözeltinin 10 ml’si (10 ml ; 0,5g numuneye eşdeğerdir) immunafinite kolondan hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla olacak şekilde geçirilir.

3.      Daha sonra immunafinite kolonu 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde 2 kere saf su ile yıkanır, saf suyun kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.

4.      Daha sonra kolondan1 damla/sn hızla 1 ml metanol geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

5.      Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

6.      Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir. Toplanan 2 ml çözeltinin her bir milimetresi  1 g numuneye eşdeğerdir.

Okratoksin Analizi :

  Analiz numunesi öğütülüp iyice homojenize edildikten sonra, bir blendera 10 g numune tartılır.

  Üzerine %1 lik sodyum bikarbonattan 200 ml ilave edilir.

  Blenderda yüksek devirde 3 dk karıştırılır.

  Blenderdaki içerik santrifüj tüplerine aktarılıp santrifüjlenir ve ardından erlene süzülür.

  Kolondan geçirmek üzere PBS hazırlanır. 100’lük balon jojeye fosfat buffered solue tabletten 1 adet atılır ve üzeri UP ile tamamlanır. Balık atıp magnetik karıştırıcı ile karıştırılır.

  Filtreden geçirilmiş süzüntünün 20 ml’si, 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde hava kabarcığı çıkana kadar saniyede 1-2 damla hızla kolondan geçirilir.

  Daha sonra hazırlanan PBS’ den  20 ml, 10 ml’lik porsiyonlar şeklinde olacak şekilde kolondan geçirilir. Kolondan geçiş hızı saniyede 1-2 damla olmalıdır.

  Daha sonra kolondan1 damla/sn hızla 1,5 ml MeOH : asetik asit (98:2) geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır.

  Kolondan 1 damla/sn hızla 1 ml ultrasaf su geçirilir ve bu çözelti aynı vialde toplanır. Kolondan geçirilirken karışması önemlidir. Bu yüzden şırınga ile içine hava verilip çekilerek geçirilir.

  Vial içeriği iyice karıştırılır ve HPLC cihazına enjekte edilir.

Boya Analizi :

  5 gr numune erlene tartılır.

  Üzerine 50 ml UP (ultrapure) eklenir.

  İçine balık atarak magnetik karıştırıcıda karıştırılır.

  Filtreden geçirilir. ve süzüntü erlende toplanır.

  Kolondan geçirilmek üzere propanol, % 1’lik asetik asit ve % 70’lik etanol ayı ayrı beherlere konulup üzerleri uçmayı engellemek için saat camıyla kapatılır.

  Kolonu şartlamak için 5 ml prapanol enjektöre alınarak kolondan geçirilir.

  Ardından 5 ml asetik asit başka bir enjektörle alınarak kolondan geçirilir.

  Böylece kolon şartlaması gerçekleşmiş olur.

  Şartlanmış kolondan 10 ml numune süzüntüsü geçirilir.

  Doğal boyayı atmak için 5 ml propanol kolondan geçirilir.

  Suni boyayı atmak için 5 ml etanolü kolondan geçirilir ve süzüntüsü bir tüpte toplanır.

  En son aşamada tüpte toplanan süzüntüden 1 ml alınır ve 10 ml saf su ile seyreltirilir.

  Spektroskopi cihazına verip analiz tamamlanır.

Sorbik Asit / Benzoik Asit Analizi :

  5 gr numune tartılır.

  Numune 100’lük balon jojeye koyulup üzerine 30 ml ultra saf su (UP) eklenir.

  Sonra metenolle tamamlanıp karıştır.

  Karışım süzülür ve  enjektör ile filtreden geçirilip viale toplanır.

  Vial  cihaza verilir.

Protein Tayini :

  Homojen hala getirilen numuneden 0,3 g tartılır.

  Üzerine 25 ml sülfrik  asit ve 1 adet kheldaki  tableti ilave edilir.

  Yakma ünitesine koyu yeşil sıvı elde edilinceye kadar yerleştirilip yakılır. Yakma ünitesinin sıcaklığı 420 oC civarındadır.

  İstenilen renk elde edilince soğumaya alınır.

  Geri soğutucusu açık olan protein cihazında %32’lık sodyum hidroksit ve saf su ile karışarak, geri soğutucuya çarpar ve %4’lük 50 ml barik asitin içeren erlene  damlar.

  Erlendeki birikinti üzerine 1-2 damla brom kresool red indikatör ilave edilir.

   0.1N’lik HCL ile titre edilir.

  Sarfiyat miktarı formülde yerine konularak protein yüzdesi hesaplanmış olur.

  Aynı işlemler numunesiz olarak gerçekleştirilerek kör hazırlanır ve körün titrasyondaki sarfiyatı bulunur.

Sabit değer ;

– Bakliyat ürünleri için 5,80

– Et ve et ürünleri için 6,25

– Süt ve süt ürünleri için 6,38

Mikrobiyolojinin Tarihçesi ( Dr. Halil TOSUN )

Antony van Leeuwenhoek • 1632- 1723 • Mikrobiyolojinin kurucusu kabul edilir • İlk kez mikroskop yardımı ile mikroorganizmaları gözlemlemiştir • Mikroskobik hayvancık adını vermiştir • 200x büyütme elde etmiştir

• Spontan Generasyon • Biyogenesis Teorisi Teorisi (Abiyogenesis) • Canlıların kendi • Her canlı daha önce kendine meydana var olan bir başka geldiği görüşüdür canlıdan meydana • Ör: Havada kalmış gelmiştir görüşüdür etlerde kurtçuk oluşması gibi

Francesco Redi(1626-1697) • Canlıların kendinden önceki canlılardan meydana geldiğini ilk ispatlayan bilim adamıdır • Böylelikle yüksek organizmalar için spontan generasyon teorisi reddedilmiştir

Mikroorganizmalar için hangi teori doğrudur? • John Needham (1713-1781) • Lazzaro Spallanzani (1729- • Isıtılarak ağzı kapatılan 1799) kavanozda bulunan et suyu • Aynı deneyi tekrarlamış yeterli içinde mikroorganizmaların derece ve sürede ısıtma ürediğini görmüş bunların yapıldığında ve kavanoz ağzı tahrip olduktan sonra yeniden iyice kapatıldığında kendiliğinden oluştuklarını mikroorganizmaların savunmuştur (abiogenesis) üremediğini göstermiştir (biogenesis)

Mikroorganizmalar için hangi teori doğrudur? • Lavoisier 1775 • Louis Pasteur (1820- • Havadaki oksijenin 1895) varlığını ispatlamış • Yaptığı deneyle abiogenesis teorisinin • Kaynatılan gıdalarda mümkün olamayacağını oksijen bulunmadığı göstermiştir için üreme olmadığın • Mikroorganizmaların savunarak spontan toz parçacıkları ile generasyon teorisini taşındığını keşfetmiştir desteklemiştir

Louis Pasteur (1820- 1895) • Mikroorganizmaların sıcaklık uygulaması ile öldürülebileceğini göstermiştir(pastörizasyon) • İlk kez hayvanlarda aşı uygulaması yapmıştır • Bira ve şarabın ısıtılarak raf ömrünün uzatılabileceğini göstermiştir.

Mikroorganizmaların hastalıklarla ilişkisi • GERM TEORİSİ • Pasteur: İpek böceği • Mikroorganizmalar hastalığına hastalığa neden protozoaların neden olmakta ve hastalığı olduğunu bulmuştur canlıdan canlıya yayabilmektedir (Marcus Antonius von Plenciz, 1792)

Joseph Lister (1827- 1912) • Cerrahide enfeksiyonları engellemek için pasteur prensiplerini uygulamış ve dezenfeksiyonun önemini ortaya koymuştur • Tıpta kullanılan aletleri fenolle dezenfekte etmiştir.

Robert KOCH (1843- 1910) • Katı besiyerini geliştirmiştir • Saf kültür olarak mikroorganizmaları izole etmiştir • Şarbon hastalığına neden olan mikroorganizmayı saf kültür olarak izole etmiştir • Bakterileri anilin boyalarla boyamıştır • İlk kez yayma preperat hazırlamıştır

Robert KOCH (1843- 1910) Mikroorganizmal arla hastalıklar arasındaki ilişkiyi göstermiştir. Bu ilkeler günümüzde de geçerliliğini sürdüren Koch’un önermeleri olarak bilinir

Koch Postulatları • Hastalıklar spesifik mikroorganizmalar tarafından oluşturulurlar, • Etkenler izole edilmeli ve saf kültürler halinde üretilmelidir, • Duyarlı sağlam deneme hayvanlarına verildiklerinde hastalık oluşturabilmeli ve • Tekrar saf kültürler halinde üretilebilmelidirler.

Analiz İçin Örnek Alınması ( Velittin GÜRGÜN, A. Kadir HALKMAN )

1 Analiz İçin Örnek Alınması Velittin GÜRGÜN, A. Kadir HALKMAN 01. Genel Bilgiler 02. Örnek Miktarının Belirlenmesi 02.01. Örnekleme Planı 02.02. İki ve Üç Sınıflı Planlar 03. Örnek Alınması 03.01. Parti 03.02. Ürün Cinsi 03.03. Kaynak Örnekler – Birim Örnekler 03.04. Örnek Alma Ekipmanı 04. Örneklerin Analize Hazırlanması 01. Genel Bilgiler Yukarıda ilgili bölümlerde belirtildiği gibi bazı materyallerde (örneğin süt ürünleri için starter kültür, baklagil için inokülant vb) bulunması gereken mikroorganizma sayısı «en az» olarak belirtilirken, gıdalarda bulunmasına izin verilebilen istenmeyen mikroorganizma sayılan «en çok» ile sınırlandırılmıştır. Bu durumda, örneğin, biyolojik kontrolde kullanılan bir preparatta bulunması gereken en az bakteri sayısı ile pastörize sütte bulunmasına izin verilen toplam mezofil aerobik bakteri sayısı birbirlerinden oldukça farklı yöntemler ile belirlenir. Yöntemler arasındaki farklılaşma en açık olarak, bu materyallerden analiz için örnek alınması ve örneklerin analize hazırlanması gibi ilk aşamalarda görülür. Her materyal için mikrobiyolojik kontrol; örnek alınması, analiz yöntemlerinin belirlenmesi ve elde edilecek sonuçların değerlendirilmesi olmak üzere birbirini takip eden üç basamakta gerçekleştirilir. Uygulamada bu üç basamak iç içedir ve birbirlerine bağlıdırlar. Bir materyalden örnek alınması denildiğinde sırası ile; materyali temsil edecek örnek miktarının belirlenmesi, örneğin alınması, laboratuvara getirilmesi ve seçilen yönteme göre analize hazırlanması anlaşılır. Bu bölümde genel olarak gıdalardan analiz için örnek alınması üzerinde durulmuş ve bu çerçevede örnek alımındaki yaklaşımlar açıklanmıştır. 02. Örnek Miktarının Belirlenmesi Analiz için ne kadar örneğin gerektiği ve bunların nereden alınmasının doğru olacağı en önemli soru olarak ortaya çıkar. Bu soruların yanıtlanması öncelikle söz konusu gıdanın mikrobiyolojik geçmişinin bilinmesine bağlıdır. Yüksek kalitedeki hammaddeden ileri tek- nolojiler ile ve hijyenik koşullar altında üretilen ve üretimin pek çok aşamasında mikrobiyolojik kontrolleri yapılan bir gıda maddesinden mikrobiyolojik analiz için alınacak örnek miktarı ile bunun tersi koşullarda üretildiği bilinen bir gıdadan alınacak örnek miktarı 1 “Mikrobiyolojide Sayım Yöntemleri; 2. Baskı. Prof. Dr. Velittin Gürgün, Doç. Dr. Kadir Halkman. 1990. Gıda Teknolojisi Derneği Yayın no 7. Ankara” adlı kitabın bölümüdür.

kuşkusuz aynı olmayacaktır. Bunun yanında, ithal edilmiş gıdalarda olduğu gibi, mikrobiyolojik geçmişi hiç bilinmeyen gıdalardan alınacak örnek miktarı ise ayrı bir sorundur. Alınacak örnek sayısı veya birimine karar vermeden önce, birden fazla örnek alınması halinde elde edilecek sonuçların öneminin anlaşılması gerekir. Hiçbir örnekleme programı, örnek alınan partide bulunan her bir birimi kapsamadığı için partide kabul edilmeyecek bir birim bulunmadığını garanti edemez. Gıdaların büyük bir bölümü tüketime terk edileceğine göre kontrol için çok daha az örnek alınması doğru olacaktır. Bu sayı küçüldükçe istenmeyen bir birimin tespit edilememe olasılığı o nispette büyüyecektir. Partiyi temsil etmek üzere alınacak örnek sayısı her ülkenin standartlarında farklıdır. Bunun yanında, ürün cinsi ve muhtemel bozuk birim oranı gibi faktörler de örnek sayısını etkiler. Genel olarak, partiyi temsil etmek üzere % 2 oranında örnek alınması alışılagelmiş bir uygulamadır. 1.000 adetlik bir partiden % 2 oranı ile 20 adet örnek aldığımızı varsayalım. Partideki gerçek bozuk birim oranı % 5 ise alınan örnek ile bu bozukluk % 67 olasılıkla belirlenebilecektir. Bir diğer deyişle, partiden seçilen 20 adet örnek % 67 olasılıkla partide bozuk birimlerin olduğunu gösterecektir. Partideki gerçek bozukluk oranı % 10 ise, bu kez 20 örnek ile bozukluk, % 88 olasılıkla belirlenecektir. Partideki ürün sayısı azaldıkça, % 2’lik örnek alımının partideki bozukluğu ortaya çıkarma şansı da azalır. Şöyle ki, 500 adetlik bir partiden % 2 oranıyla 10 örnek alındığında yukarıdaki kontaminasyon düzeylerinde bozuk birim varlığını ortaya çıkaramama olasılığı yükselecektir. Genel bir kural olarak, analize sunulan bir partideki örnek sayısının kare kökü kadar örnek alınması önerilmektedir. Analiz için alınacak örnek sayısı, küçük partilerde % 10’lara kadar çıkartılabileceği gibi, büyük partilerde % 1’in altına da indirilebilir. Bir gıda maddesi kontrol edilirken, sonucun önceden bilinmesi mümkün değildir. Test sonucu, belli bir mikroorganizma için pozitif ya da negatif olarak elde edilebilir. Burada pozitiften kasıt sayım sonucuna (ya da Salmonella için var/yok şeklinde belirleme) göre gıda maddesinde izin verilenden fazla sayıda mikroorganizma bulunmasıdır, bu durumda gıda maddesi mikrobiyel kalite açısından reddedilir. Negatif sonuç ise gıda maddesinin standartlara uygunluğunu gösterir, yani mikrobiyel açıdan gıda maddesi kabul edilir. Eğer gıda, fazla sayıda mikroorganizma içeriyorsa, bu tip testlerin çoğunluğu pozitif çıkar, dolayısıyla pozitif test olasılığı yükselir. Fakat gıdada çok az sayıda mikroorganizma varsa, kontrolün pozitif sonuç verme olasılığı oldukça azdır. Olasılık değerleri 0 -1 arasında değişir. Yukarıdaki durumlarda «0» olasılığının anlamı, pozitif sonuç elde etme şansının hiç olmadığı, yani gıdada hiçbir mikroorganizmanın bulunmadığı şeklindedir. Olasılığın «1» olmasının anlamı ise gıdada o kadar çok organizma vardır ki, her kontrolde mutlaka pozitif sonuç elde edilecektir. Belli bir gıdada ne kadar çok örnek kontrol edilirse, mikroorganizmanın izole edilme şansının da o denli artacağı açıktır. Bunun tersi olarak, test edilen örnek sayısı ne kadar azsa, herhangi bir kontaminasyonu belirleme şansıda o denli azalacaktır. Bu nedenle, elde edilen sonuçların, gıdanın gerçek durumunu yansıtabilmesi için, örnek sayısının dikkatle belirlenmesi gerekir. Göz önünde bulundurulması gereken önemli iki husus, daha sonra tartışılacağı gibi örnekleme işlemi sırasında tercihten kaçınılması ve örnekleme planıdır.

02.01. Örnekleme Planı Örnekleme planı, partiyi temsilen seçilen belirli bir örnek grubu içinde, istenilen mikrobiyel kritere göre tüm partinin kabul ya da red edilmesi için kaç örnekte (+) sonuca izin verileceğini gösteren bir plandır. Bu planda n = örnek sayısı, c = örnek grubu içinde izin verilen bozuk birim sayısını göstermektedir. Buna göre n = 10, c = 2 planında partiyi temsilen 10 adet örnek alındığında, bu örneklerden 2 ya da daha azı aranan mikroorganizma bakımından (+) sonuç verirse, tüm parti standartlara yeteri kadar uyduğu gerekçesi ile kabul edilir, ancak 3 ve daha fazlasında (+) birime rastlanırsa tüm parti bu kez reddedilir, n = 15, c = 0 planında ise, 15 adet olarak seçilen örnek grubu içinde ancak 0 adet (+) birime rastlanırsa parti kabul edilecek anlamındadır. Kuşkusuz, tüm partiyi temsil etmek üzere seçilecek örnek sayısı (n) ile örnek içinde (+) birime izin verilen sayı (c) öncelikle ürün cinsine ve mikroorganizma sayısına bağlıdır. Örneğin, dondurmalarda Salmonella aranıyorsa yüksek «n» değerleri ve «c = 0» planı, toplam mezofil aerob bakteri aranıyorsa standart ve tüzüklerin izin verdiği kriterlere bağlı olarak daha düşük «n» değerleri, ancak 1 – 2 gibi daha yüksek «c» değerleri kullanılabilir. Herhangi bir gıda maddesinden n = 10, c = 2 planı ile örnekleme ve mikrobiyolojik kontroller yapıldığını varsayalım. Partideki istenmeyen birim sayısı % 10 ise, teorik olarak 10 adetlik örnek grubu içinde 1 adet (+) sonuç alınacak ve c = 2 olduğuna göre, parti kabul edilecektir. Diğer yandan, uygulamada 10 birimlik örnek grubu içinde 0-10 arasında (+) sonuç alınması da mümkündür. Bununla beraber, şekilde verilen, örnekleme planı güvenilirlik eğrilerinden görüldüğü gibi, (c) değeri arttıkça, aynı (n) değeri ve partideki aynı gerçek bozukluk yüzdesi için tüm partinin kabul edilme olasılığı artmaktadır.

Şekilden n = 10 değeri ve 4 farklı «c» değerinin gerçek bozukluğu nasıl yansıttığını izleyelim. Partideki gerçek bozuk birim oranının % 20 olduğunu varsayalım. Eğer, n = 10, c = 0 örnekleme planını seçersek partiyi % 17 olasılıkla kabul ederiz. Bu değeri bulmak için partideki gerçek bozukluğu gösteren yatay eksendeki % 20’den dik çıkılıp, c = 0 eğrisini kestiği yerde, partinin kabul edilme şansını gösteren dikey eksene dik çizmek ve bu ekseni kestiği yerde yüzde kabul edilme şansını bulmak yeterlidir. Partideki gerçek bozukluk oranı % 20 iken n = 10, c = 0 örnekleme planı ile partiyi kabul etme şansı % 17 dir. Bir başka yaklaşımla; gerçek bozukluk oranı % 20 olan bir partiden 100 adet 10’lu gruplar halinde örnek seçilse, mikrobiyolojik kontroller sonunda 100 grubun 17 sinde 0 adet (+) birime, 83 ünde ise 10’ar örneğin en az 1 adedinde (+) birime rastlanılması beklenir. Aynı parti için n = 10 c = 1 planında bu kez partiyi kabul etme olasılığı % 38’dir. Yani ancak % 38’lik bir şans ile seçilen 10 örneğin en çok 1 adedinde (+) birime rastlanabilir. Bu değerler n = 10, c = 2 planı için % 68 ve n = 10, c = 3 planı için % 87 dir. n = 10, c = 2 planı ile farklı gerçek bozuklukların kabul edilme olasılıkları aşağıda verilmiştir. Partideki gerçek bozukluk oranı % = 0 10 20 30 40 50 60 Partinin kabul edilme olasılığı % = 100 93 68 38 17 5 1 Yukarıdaki değerler, partiyi temsilen 10 örnek seçildiğinde, bunlardan en çok 2 adedinde (+) sonuç alınması halinde partideki gerçek bozukluk oranına göre partinin kabul edilme olasılığını göstermektedir. Yani n = 10, c = 2 planı seçilmişse ve partideki gerçek bozukluk % 10 ise % 93 olasılıkla 10 örneğin 2 ve daha azı (+) sonuç verecek ve parti kabul edilecektir. Gerçek bozukluk oranı % 60 ise bu kez % 1 olasılıkla 10 örneğin 2 ve daha azı (+) sonuç verecek ve parti kabul edilecektir. Bir diğer deyiş ile partideki gerçek bozukluk oranı % 60 ise % 99 olasılıkla, seçilmiş 10 örneğin 3 ve daha fazlasında (+) sonuç elde edilecek ve c = 2 olduğu için parti reddedilecektir. Şekil, aynı zamanda, «n» sayısının artması ile iyi kalite bir partinin kabul edilebilirlik olasılığının, buna karşın zayıf bir partinin reddedilme olasılığının arttığını göstermektedir. Bunlar, bir örnekleme planının arzulanan özellikleridir, çünkü yüksek kaliteli bir partinin reddedilme olasılığı az olduğu gibi (üreticinin avantajı), düşük kaliteli bir partinin kabul edilebilirlik olasılığı da azdır (tüketici avantajı). 02.02. İki ve Üç Sınıflı Planlar Bir gıda maddesinde Salmonella ve E. coli gibi mikroorganizmaların varlığına izin verilmez. Bunlardan özellikle Salmonella gibi patojen olanlar genellikle sayılmaz, sadece var/yok şeklinde belirtilir. Bunun yanında, maya ve küf ile toplam bakterilere ise, bir sınıra kadar izin verilebilir. Örnekleme planı, partinin tümünü kabul ya da red şeklindeyse bu iki sınıflı bir plandır. Bu planda «c» yukarıda belirtildiği gibi, ya aranan mikroorganizmanın var/yok, ya da izin verilen sayının altında/ üstünde olmasına göre partinin tamamen kabul veya red edilmesi üzerine etkili olan bir değerdir.

Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuvarı ( A. Kadir HALKMAN, Hilal B. DOĞAN )

Gıda Mikrobiyolojisi Laboratuvarı A. Kadir HALKMAN, Hilal B. DOĞAN Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü

01. Genel Bilgiler 02. Personel 03. Fiziki Yerleşim 04. Laboratuvar Cihazları ve Ekipman 04.01. Otoklav 04.02. İnkübatör 04.03. Etüv (Kuru Hava Sterilizatörü) 04.04. Su Destilasyonu 04.05. Hassas Terazi 04.06. pH metre 04.07. Karıştırıcılar 04.08. Homojenizatörler 04.09. Su Banyoları 04.10. Aşılama Kabini 04.11. Diğer Cihazlar 04.12. Ekipman 05. Tipik Laboratuvar Hataları 05.01. Genel Laboratuvar Hataları 05.02. Örnek Hazırlanması ve Ekim Hataları 05.03. Besiyerlerinin Hazırlanmasındaki Hatalar 05.04. Testlerde Yapılan Hatalar 05.05. Değerlendirme Hataları 06. Laboratuvarın Otokontrolü 01. Genel Bilgiler Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı, gıda hammaddelerinde, yardımcı maddelerinde, çalışma ekipmanı ve atmosferinde, ambalaj materyalinde, kullanma suyunda ve nihayet gıdada bulunabilen mikroorganizmaların arandığı ve/veya sayıldığı bir laboratuvardır. Genel olarak yoğurt, kefir gibi fermente süt ürünleri ile boza gibi mikroorganizma gelişmesi ile elde edilen ürünler dışındaki gıdalarda mikroorganizma bulunması istenmez. Bununla beraber çoğu gıdadan mikroorganizmaları tümüyle arındırmak hemen hemen olanaksızdır. Bu durumda gıda çeşidine göre belirli mikroorganizmaların gıdalarda bulunması kaçınılmazdır. Başta gıdanın elde edildiği hammaddede doğal olarak bulunabilen, insan sağlığına zarar vermeyen ve işlem gereği tümüyle öldürülemeyen bu mikroorganizmaların belirli sayılarda gıda maddesinde bulunmasına izin verilebilir. Bu grup mikroorganizmaların yüksek sayılarda bulunması ise işletmenin gereken hijyenik çalışma kurallarına yeterince uymadığının göstergesi olarak kabul edilir ve bunlar genel kalite kriteri kapsamı içinde sayılarak gıdanın belirlenmiş mikroorganizma kalite sınırları içinde olup olmadığı kontrol edilir. Kuşkusuz, toplam mezofil aerob bakteri, maya ve küf, koliform grup bakteriler gibi genel mikroorganizmaların varlığına verilen izin öncelikle, gıdanın çeşidine daha sonra ulusal 1 Kaynak : Gıda Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları, 2000. Genişletilmiş 2. Baskı; Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü yayını. Sim Matbaası, Ankara 522 s 04. Bölüm

standartlara ve gerek uluslararası gerek ulusal ticarette alıcı konumundaki kuruluşun kendi belirlediği standartlara bağlıdır. Bununla beraber hiç bir gıdada patojen mikroorganizma bulunmasına izin verilmez. İnsan sağlığını doğrudan tehdit eden Salmonella, Listeria monocytogenes , Escherichia coli O157:H7 serotipi gibi primer patojenler hangi ülkede, hangi koşulla üretilirse üretilsin ve hangi çeşit olursa olsun gıdalarda bulunmamalıdır. Bu nedenle bu gibi mikroorganizmaların gıdalarda sayılmasına gerek yoktur. Bunların sayısı analiz edilen gıdada 0 olması gerektiğine göre belirli bir miktar (genellikle 25 g ya da 25 ml) gıdada bunların varlığının araştırılması yeterlidir. Gıdalarda bulunmasına izin verilmeyen bir başka mikroorganizma grubu ise fekal kontaminasyon indeksi olan mikroorganizmalardır. E. coli tip 1 gibi patojen olmadığı halde doğal bulunma yeri sıcak kanlı hayvanların bağırsakları ve dolayısı ile dışkıları olan bakteriler tüketime hazır gıdalarda bulunmamalıdır. Bu grup mikroorganizmalar patojenlerde olduğu gibi sayılmaz, sadece aranır. Ancak bunların patojenlere göre iki ayrıcalığı; daha az miktarda (genellikle 1 g ya da 1 ml) gıdada aranmaları ve gıdaların ışınlama ile korunmasına izin verilen ülkelerde belirli gıdalarda (örneğin baharatlarda) belirli sayılarda bulunmasına izin verilebilmesidir. Son gıda kodeksinde çiğ hayvansal ürünlerde de E. coli tip 1 bulunabilmesi gündeme gelmiştir. Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı, böylesine farklı mikroorganizma gruplarının varlığını araştıran ve/veya sayımını yapan, analiz sonuçlarını genellikle bir kaç gün sonra elde eden, çalışma ortamında (her ne kadar kapalı ortamda olsa da) patojenleri milyarlarca sayıda çoğaltan ve tümüyle kendine özgü bir disiplini olan bir laboratuvardır. Bu bölümde gıda mikrobiyolojisi laboratuvarı için personel, fiziki yerleşim, temel laboratuvar cihazları, hakkında bilgi verilmiş, laboratuvarda yapılabilen tipik hatalara değinilmiş ve bu hatalardan arınmak için laboratuvarın otokontrol mekanizması anlatılmıştır. 02. Personel Mikrobiyoloji laboratuvarında mutlaka mikrobiyoloji eğitimi almış personel çalışmalıdır. Yetki ve sorumluluk düzeyi ne olursa olsun tüm mikrobiyoloji laboratuvar personelinin uyması gereken kurallar aşağıda verilmiştir. Laboratuvarda en üst düzeydeki yetkili kendisi dahil tüm laboratuvar personelinin bu kurallara tümüyle uymasından sorumlu olmalıdır. – Mikrobiyoloji laboratuvarına laboratuvar personelinden başka hiç kimse giremez. – Laboratuvarda hiç bir yerde (ofis masaları, soyunma dolapları ve özellikle buzdolabı) analiz örnekleri dışında tüketim amaçlı gıda maddesi kesinlikle bulunamaz. – Laboratuvarda hiç bir şey kesinlikle yenilmez, içilmez. Bunun tek istisnası acil kullanılacak ilaçlardır (örneğin kalp rahatsızlıkları için kullanılacak dilaltı gibi ilaçlar). Personel içinde bu gibi hastalıkları olan ve acil durumda ilaç kullanması gereken kişiler var ise bu kişilerin kullanacağı ilaçlar laboratuvardaki ilk yardım dolabında tutulmalı, nasıl kullanılacağı konusunda laboratuvardaki personel bilgilendirilmeli, tercihen bu konuda tatbikat yapılmalıdır.

– Laboratuvarda çalışırken temiz bir önlük giyilmeli, bu önlük sadece laboratuvarda kullanılmalı, personelin önlük ile laboratuvar dışına çıkması (özellikle yemekhane ve hela) önlenmelidir. Önlüğün diz kapağını örtecek uzunlukta olması, kol boyunun uygun olması gerekir, önlüğün yanmaz kumaştan yapılmış olması tercih edilir. Mikrobiyoloji laboratuvarında kullanılacak önlüklerinin cebine kesinlikle bir şey koyulmayacağı için bu önlüklerin cepsiz olması önerilir. Tüm personelin en az 1 adet yedek temiz önlüğü bulunmalıdır. – Personel kişisel temizliğe dikkat etmek zorundadır. Tırnaklar kısa kesilmiş olmalı, saçlar uzun ise bağlanmalıdır. Saçların bağlanması hijyen dışında bunzen beki alevinde yanma tehlikesini de azaltır. Buna karşın aynı tehlike ile saçlar asla başörtüsü ile kapatılmamalıdır. Grip, nezle benzeri hastalıklara yakalanmış personel özel koruyucu maske ile, özellikle ellerinde kesik, yara olan personel laboratuvarda eldiven ile çalışmalıdır. – Laboratuvarda analiz sonuçlarını olumsuz yönde etkileyen çevre koşulları arasında toz önde gelen bir faktördür. Bu nedenle özellikle çamurlu ayakkabı ile laboratuvara girilmemelidir. – Palto, mont, hırka, çanta, benzeri kişisel malzeme tercihen laboratuvar dışında bırakılmalı, laboratuvar düzeni açısından bunların laboratuvarda bulunmasında zorunluk varsa kapalı dolaplarda korunmalıdır. Laboratuvar hijiyeni açısından laboratuvarda gereksiz her türlü malzemenin bulunması önlenmelidir. – Laboratuvarda bulunan çöp tenekeleri içine otoklavlanabilir poşetler koyulmalı, atılacak her türlü malzeme bu poşetlerde otoklavlandıktan sonra çöpe gönderilmelidir. – Sabah işe gelindiğinde öncelikle çalışma tezgahları dezenfekte edilmeli her çalışmanın bitiminde tezgahlar tekrar dezenfekte edilmelidir. Dezenfeksiyonda ticari olarak pazarlanan pek çok dezenfektan kullanılabilir. Laboratuvara her giriş ve çıkışta özellikle eller dezenfekte edilmelidir. – Mikroorganizma üremiş materyalin kırılması ve/veya mikroorganizma kültürünün dökülmesi durumunda karantina uygulanmalı, mikroorganizma dökülen yer ve bu yerin hemen üzerindeki hava dezenfekte edilmeli, dezenfeksiyon ve kırılmış malzemenin toplanmasında eldiven ile çalışılmalıdır. Havanın dezenfeksiyonu için aerosol etkili sistemler kullanılmalıdır. Dezenfeksiyon işlemi bittikten sonra dezenfeksiyonu yapan kişilerin eldivenleri, önlükleri sterilize edilmelidir. 03. Fiziki Yerleşim Bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarının en önemli özellikleri arasında ayrı bir ekim odası bulunması gerektiğidir. Bu oda genel ve basit olarak ana laboratuvar bölmesinden cam ile ayrılmış bir bölme şeklinde kurulabilir. Eğer mikrobiyoloji laboratuvarı bir genel laboratuvar içinde ise böyle bir bölme olması zorunludur. Laboratuvar sadece mikrobiyoloji amaçlı kullanılıyor ise ve laboratuvarda sadece mikrobiyoloji uzmanları ve teknisyenleri çalışıyor ise ayrı bir ekim odasına gerek duyulmayabilir. Hiç bir koşulda starter kültür gibi bulunması istenilen mikroorganizmaların üretildiği laboratuvar ile istenmeyen mikroorganizmaların analizin doğası gereği çoğaltıldığı laboratuvarın aynı olması kabul edilemez. Bunlar fiziki yerleşim ve personel olarak tümüyle ayrı iki laboratuvar olmalıdır.

Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarının fiziki yerleşimi planlanırken dikkat edilmesi gereken en önemli hususlar aşağıda özetlenmiştir. – Tüm mikrobiyoloji laboratuvarlarının ortak özelliği materyalin çalışana, çalışanın materyale zarar vermemesidir. Bu çerçevede mikrobiyoloji laboratuvarının fiziki yerleşimi önemlidir. Fiziki yerleşim materyal ve çalışan arasında karşılıklı güvenliği sağlamalı, ayrıca çalışan için rahat bir ortam yaratmalıdır. – Duvarlar, döşeme, tezgahlar rahatlıkla temizlenebilecek şekilde düzgün olmalı, deterjan ve dezenfektanlardan etkilenmemelidir. – Mikrobiyoloji laboratuvarının fiziki ölçüleri olarak en ideali 3 m en, 6 m boy ve 3 m yüksekliktir. 3 m en 2-3 kişinin çalışabileceği yeterli tezgah alanı sağlar. 4 m ‘den fazla en laboratuvarda kullanılmayan ve genellikle gereksiz olan ekipman ile doldurulan atıl alanlar bırakır. Laboratuvar boyu olarak genelde 5- 7,5 m seçilmekte ise de en uygun olarak saptanan 6 m ‘dir. Yükseklik ise çeker ocak, aşılama kabini gibi sistemler için en az 3 m ‘dir. Bir başka 2 yaklaşıma göre her çalışan için 20 m alan gerekir. – Laboratuvarda toz bulunmamalı, fiziki yerleşimde buna dikkat edilmelidir. Bu amaçla laboratuvar tezgahları, cihazlar, mobilyalar, vs. ‘nin toz tutma yüzeyleri az olmalı, her yer rahatlıkla temizlenebilmelidir. Bu amaçla dolaplar tavana kadar yapılmalı, laboratuvar tezgahları döşemeden rahatlıkla temizlenebilecek kadar yüksekte (20 cm kadar) olmalıdır. – Havalandırma nem ve sıcaklığı kontrol edecek, laboratuvara taze hava sağlayacak şekilde yapılmalıdır. Pencereden sağlanan doğal vantilasyon son yıllarda yerini mekanik vantilasyona bırakmıştır. Bu şekilde gerektiğinde ısıtma ve soğutma yapılabilir, basit ve ucuz önlemler ile içeriye verilen hava filtre edilerek en azından tozlanmanın önüne geçilebilir. Bu tip havalandırmalarda laboratuvara verilen basınçlı havanın uzaklaştırılması için ayrıca bir hava emme sistemine gerek vardır. Patojenler ve/veya özellikle küflerle çalışılan laboratuvarlarda dışarı atılan havanın da filtre edilmesi gerekir. Çalışma anında laboratuvar kapı ve pencereleri kapalı tutulmalı, açılabilen pencerelerde mutlaka sinek teli bulunmalıdır. Laboratuvar sıcaklığı çalışmaya uygun olmalıdır. – Laboratuvarda yeterli sayıda elektrik prizi (monofaz ve trifaz), su musluğu ve buna bağlı olarak eviye, havagazı, ve basınçlı hava musluğu bulunmalıdır. Muslukların (su, basınçlı hava ve hava gazı) ayrıca basit açma/kapatma vanaları, prizlerin sigortaları olmalıdır. Gerektiğinde elektrik, havagazı, basınçlı hava ve suyu ivedilikle ve basit olarak kapatılabileceği önlemler alınmalıdır. Borular (su, gaz vs.) açıkta olmamalıdır. – Laboratuvara direkt güneş ışığının girmesinden kaçınılmalıdır. Gün ışığına yakın ışık veren fluoresanslı lambalar tercih edilmeli, laboratuvarda yeterli aydınlanma sağlanmalıdır. – Ekim odası ve/veya mikrobiyoloji laboratuvarında UV lambası kullanılarak havada ve ışını alabilen düzgün yüzeylerde yeterli sterilizasyon sağlanabilir. Bunun en pratik uygulaması yeterli sayıda ve doğru yerleştirilmiş UV lambalarının çalışma saati dışında (örneğin gece boyunca ve/veya yemek/dinlenme aralarında) açık bırakılmasıdır. Burada en önemli husus UV ışığının gözlerde körlük, deride kanser yapabileceğinin unutulmamasıdır. Bu konuda en basit ancak en etkili önlemler UV lambalarına kumanda eden düğmenin oda dışında bulunması, lamba açık iken dışarıda uyarı ışığı yanması, lamba açık iken kapı açılırsa ses ile uyarı sağlayacak bir güvenlik önleminin alınmasıdır. Genel laboratuvar içinde bulunacak camlı ekim

odasında yanacak UV lambasının ekim odası dışında çalışanlara zararı olmaz. Bunun nedeni UV ışını spektrumundaki zararlı ışınların camdan dışarı geçememesidir. – Otoklav ve yıkama odası tercihen mikrobiyoloji laboratuvarı dışında olmalıdır. Bunun nedeni laboratuvarda aşırı nemden kaçınmaktır. – Besiyerleri ve kimyasal maddeler kuru, serin ve karanlık bir dolapta depolanmalıdır. Steril olan ve olmayan malzeme ayrı dolaplarda tutulmalıdır. – Başta soğutucular ve inkübatörler olmak üzere sıcaklığa duyarlı ekipmanın yerleştirilmesine özen gösterilmelidir. – Laboratuvarda ilk yardım dolabı bulunmalı ve personel en sık rastlanan kesilme, yanma gibi kazalarda ne yapması gerektiğini bilmelidir. 04. Laboratuvar Cihazları ve Ekipman 04.01. Otoklav Sadece biyolojik stabilite testi ve mikroskobik testler yapan basit laboratuvarlar dışında bir gıda mikrobiyolojisi laboratuvarının en önemli cihazları arasında otoklav bulunmaktadır. Temel görevi basınç altında buharla sterilizasyondur. Farklı marka ve modellerde, değişik kapasitelerde ve şekillerde otoklavlar bulunmaktadır. Otoklavlanacak malzemenin özelliği, miktarı, otoklavlama sıklığı gibi fonksiyonlar dikkate alınarak otoklav seçilmeli, gerektiğinde birden fazla otoklav alınmalıdır. Otoklavda sterilize edilecek besiyerleri ve çözeltiler ile kullanılmış ve yıkanmak üzere sterilize edilecek malzeme beraberce otoklavlanmamalı, tercihen bu 2 amaçla 2 farklı otoklav kullanılmalıdır. Eğer otoklavda otomatik bir hava boşaltma sistemi yoksa otoklav içindeki havanın iyice çıktığından emin oluncaya kadar buhar çıkış vanası açık tutulmalıdır. Bu vanadan sürekli ve düzenli olarak buhar çıkışı havanın boşaldığının göstergesidir. Mikrobiyoloji laboratuvarında hatalı kullanıldığı için sahte pozitif ve sahte negatif sonuçların alınmasına neden olan cihazların başında otoklav gelir. Arıza nedeni ile geç ısınan ve/veya öğle yemeği vb. nedenlerle geç soğutulan otoklavdaki besiyeri gereğinden fazla ısı yüküne maruz kaldığından besiyeri performansı azalır. Besiyerlerinin sterilizasyonu için kullanılacak otoklav çabuk ısınıp normal sürede soğutulmalıdır. Otoklav içi sıcaklığının doğruluğu ise termokopul ile test edilmelidir. 04.02. İnkübatör Yine laboratuvarın çalışma yüküne ve amaçlara göre farklı sıcaklıklarda çalışan (20-28 oC; 37 o o C; 55 C vb.), farklı büyüklüklerde, standart, anaerobik (vakumlu veya karbondioksitli), geri soğutmalı, çalkalamalı gibi çeşitli özelliklerde inkübatör(ler) mikrobiyoloji laboratuvarının önem sırası açısından önde gelen cihazları arasındadır. Mikrobiyoloji laboratuvarında inkübatörler prensip olarak kurutma ve/veya sterilizasyon amacı ile kullanılmamalıdır. İnkübatörlerde sıcaklık değişimi ±1 oC olmalı, aşırı dolumdan kaçınılmalı, yerleştirmede hava sirkülasyonu sağlanacak şekilde boşluklar bırakılmalıdır. Petri kutuları ve tüpler inkübatörün

yan duvarlarından 25 mm içeriye yerleştirilmeli, inkübatörün sıcaklık değişimi sık sık minimum-maksimum termometre ile kontrol edilmelidir. Laboratuvarın çalışma düzeni inkübatörün kapağını en az açık tutacak şekilde planlanmalıdır. İnkübatörlere direk güneş ışığı gelmesi önlenmeli, düzenli olarak temizlik ve dezenfeksiyon yapılmalıdır. İnkübatörde üst üste 6 ‘dan fazla petri kutusu konulmamalı, petri kutuları arasında hava sirkülasyonu sağlamak için en az 25 mm boşluk bırakılmalıdır. 04.03. Etüv (Kuru Hava Sterilizatörü) o Yıkanmış cam malzemenin kurutulması için 50-60 C sıcaklıklarda çalışan bir etüv ile cam ve metal malzemenin sterilizasyonu için, 180 oC’ da sıcaklıkta çalışan bir etüve gerek vardır. Sterilizasyon amaçlı etüv kurutma amacı ile de kullanılabilir. Etüvde sadece cam ve metal malzeme sterilize edilmeli, düzenli olarak temizlik yapılmalıdır. Kurutma amaçlı kullanılan ayrı bir etüv varsa düzenli temizliğe ilaveten belirli aralıklarla dezenfeksiyon yapılmalıdır. 04.04. Su Destilasyonu Besiyerlerinin hazırlanması için kullanılacak olan su cam destilatörde destile edilmiş olmalıdır. Bunun nedeni metal destilatörlerde destile su içinde metal iyonları kalabilmesi, bunun mikrobiyel gelişmeyi inhibe edici özellik gösterebilmesi, oysa cam destilatörlerden suya bu şekilde bir olumsuzluk geçmemesidir. Çeşitli çözeltilerin hazırlanmasında ve/veya yıkanmış malzemenin durulanmasında metal destilatörden elde edilen su veya deiyonizatörden elde edilen su kullanılabilir. Ancak iyon değiştirici kolonlardan elde edilen demineralize suyun yüksek sayıda mikroorganizma bulundurabileceği unutulmamalıdır. Mikrobiyoloji laboratuvarında taze hazırlanmış ve pH’sı 6,5 – 7,5 olan suyun kullanılması önerilir. Depolanmış suda atmosferik karbondioksit absorbsiyonuna bağlı olarak asidik özellik kazanma eğilimi vardır. Besiyeri bileşiminde kullanılacak su depolanacak ise kapların temizliğine özen gösterilmesi, kapların depolama öncesi iyice yıkanması ve saf su ile durulanması gerekir. 04.05. Hassas Terazi Tercihen ± 0,01 g ve ± 0,0001 g duyarlıkta 2 adet hassas terazi bulunmalı, teraziler kolaylıkla temizlenebilir modellerden seçilmelidir. Hassas terazi laboratuvarda titreşimlerden arındırılmış düzgün bir yere konulmalı (bir başka deyiş ile hassas terazinin bulunduğu tezgahta çalkalamalı su banyosu, homojenizatör vb. cihazlar olmamalı), hassas terazi yer değiştirilmemelidir. Terazi, haftada en az 1 kez standart ağırlık ile kontrol edilmeli, standart ağırlık ile ölçülen ağırlık arasında fark varsa yetkili servise başvurulmalı, yılda en az 1 kez yetkili servis tarafından kalibrasyon yapılmalıdır. 04.06. pH metre pH metre üretici firmanın önerisi doğrultusunda kullanılmalı, ölçümden ve temizlendikten sonra yine üretici firma önerisi doğrultusunda elektrot korunmalıdır. pH metre her gün standart test çözeltileri ile (en yaygın kullanılanlar 4,00; 7,00; 11,00) kontrol ve gerekirse kalibre edilmelidir.

04.07. Karıştırıcılar Amaca uygun manyetik karıştırıcı ve tüp karıştırıcısı her mikrobiyoloji laboratuvarında bulunması gereken basit ancak önemli cihazlardır. Manyetik karıştırıcının ısıtıcı tablaya sahip olması çoğu kez tercih edilen bir durumdur. 04.08. Homojenizatörler Katı örneklerin ilk çözeltilerini yapmak için çok farklı sistemler ve cihazlar bulunmaktadır. Bu cihazlar başlıca steril torbalı peristaltik homojenizatörler (stomacher) ve rotary homojenizatörler (blender) olarak iki grupta toplanır. 04.09. Su Banyoları Agarlı besiyerlerini eritmek, veya sterilizasyon sonrası donmasını önlemek ve özel çalışmalarda inkübasyon sağlamak gibi amaçlarla laboratuvarda standart, çalkalamalı, mikroprosesör kontrollü su banyoları kullanılmaktadır. Su banyolarında kullanılan su sürekli olarak yenilenmeli, düzenli olarak temizlenmeli ve dezenfekte edilmelidir. Özel inkübasyon koşullarının sağlanması için kullanılacak su banyoları mutlaka termostatik kontrol ünitesine sahip olmalı, termostatik kontrol ünitesinden bağımsız çalışan ayrı bir termometre ile su sıcaklığı kontrol edilmelidir. 04.10. Aşılama Kabini Aşılama kabini, analiz edilecek ürüne dışarıdan toz ve mikroorganizma bulaşmasını önlemek amacıyla kullanılan kabinlerdir. Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında kullanılan aşılama kabininde 1 m3 havada 4000 ‘den fazla toz partikülü bulunmamalıdır. Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında düşey tip (vertikal) laminar air-flow cihazları (tip/sınıf II kabin) kullanılmalı, yatay tip (horizontal) laminar air flow cihazları ise ancak patojen riski olmadığında kullanılmalıdır. Çalışma sırasında genel amaçlı bir agarlı besiyeri (örneğin Plate Count Agar) kapağının açık bırakılması ve çalışma sonunda bu petrinin inkübasyona bırakılması ile kabindeki mikroorganizma yükü kontrol edilebilir. 04.11. Diğer Cihazlar Laboratuvarın işlevine göre yeterli niteliklerde mikro dalga fırın, mikroskop ve/veya binoküler, santrifüj, vakum pompası, membran filtrasyon seti, soğutucu (buzdolabı ve/veya derin dondurucu), UV el lambası, koloni sayıcı, çalkalayıcı ve sallayıcı, termokopul, gibi cihazlara da gıda mikrobiyolojisi laboratuvarlarında sıklıkla rastlanmaktadır. Bunların dışında daha ziyade büyük ve araştırmaya dayalı gıda mikrobiyolojisi laboratuvarlarında gelişmiş sistemlerle çalışan bilgisayar bağıntılı sayım, identifikasyon vb. cihazları da bulunmaktadır.

04.12. Ekipman Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarının ekipmanı olarak ilk akla gelenler cam malzeme (petri kutuları, pipetler, ölçü silindirleri, balonlar, tüpler, erlenler, drigalski spatülleri, beherler, şişeler vs.), metal malzeme (spatüller, aşı özesi ve iğnesi vs.), plastik malzeme (bir kez kullanılıp atılan petri kutuları vs.), bunzen bekleri, tüp sporları ve sepetleri vb. malzeme ile temizlik ve dezenfeksiyon amaçlı malzeme, çeşitli boya ve çözelti kapları, çeşitli termometreler, manometreler özel amaçlı kaplardır. Bunlara ilaveten kirli malzemenin konulacağı özel kaplar, besiyeri ve kimyasal madde dolapları, cam malzeme dolapları, steril malzeme dolapları yine gıda mikrobiyolojisi laboratuvarının temel ekipmanı içinde yer almaktadır. Son zamanlarda sterilize edilebilir plastik malzemeden yapılmış olan erlen, balon, beher, ve mezürler gıda mikrobiyolojisi laboratuvarlarında yoğun olarak kullanılmaktadır. 05. Tipik Laboratuvar Hataları Gıda mikrobiyolojisi laboratuvarında gerçekte olduğundan daha az ya da ya da daha fazla sayım sonuçları alınabilmekte, yanlış tanımlamalara bağlı olarak sahte negatif ya da sahte pozitif bulgular elde edilebilmektedir. Bu tip hatalar pazara sunulan ürünün istenilen kalitede olmamasına ve dolayısıyla işletmenin kalite politikasına olumsuz etki yaptığı gibi yasal denetlemeler sırasında da sorun yaratmaktadır. Laboratuvarda tüp pamuklarının yanması, alkolün alev alması, pamuğun yere düşmesi, cam malzemenin kırılması ve elin kesilmesi gibi günlük aksamalar laboratuvarın iş yoğunluğu ile paralel olarak artar. İş yoğunluğunun personelin kaldıramayacağı kadar yoğun olması ve/veya laboratuvar alanının yetersizliği pek çok aksamaya neden olurken teknik bilgi eksikliği de kayda değer ölçüde sorun yaratmaktadır. Üniversiteler, kamu araştırma kuruluşları ve kamu kontrol kuruluşlarındaki laboratuvarlarda da hata olabilmektedir. Amaç en doğru sonucu almaktadır. İlgili bölümlerde tüm analizlerin en doğru şekli verilmekle beraber bu bölümde olası laboratuvar hataları toplu halde gösterilmiştir. Burada belirtilen hataların asla küçümsenmeyecek büyük bir bölümü üniversitelerde, kamu araştırma ve kontrol kuruluşlarında, gıda sanayiinde tarafımızca görülmüş olan hatalardır. 05.01. Genel Laboratuvar Hataları Çalışılan materyalin “mikrop” olduğunun unutulması. Basit bir analizde bir tüp veya petride trilyonlarla ifade edilecek sayıda mikroorganizma geliştiğinin bilinmemesi ya da dikkate alınmaması. Laboratuvarın aynı zamanda mikrobiyolojik gıda kontrolü ve starter üretimi görevini üstlenmesi. Planlama ve inşaat aşamasında laboratuvar yönü ve/veya camların konumu nedeni ile özellikle sıcak yaz aylarında laboratuvar sıcaklığının (bunzen beklerinin de etkisi ile 30 oC üzerine çıkmasına bağlı olarak 28 oC ‘da yapılması gereken inkübasyonlarda sağlıklı sonuç alınamaması, benzer şekilde inkübatörlerin güneş alan yerlere konulması.

Cam malzemenin yeteri kadar temizlenmeden ve/veya durulanmadan kullanılması, özellikle pipetlerin kirli olarak etüvde sterilize edilmesi sonucunda pipet iç yüzeyinde organik maddeler yanması ve bu durumun hem pipetteki hacimlerin rahatlıkla görülmesini engellemesi hem de bu tabaka nedeni ile daha az hacmin pipetlenmesi, yıkama sonrası iyi bir durulama yapılmaması özellikle tüplerde hazırlanan besiyerlerine ve seyreltme çözeltilerine deterjan bulaşması ve sonuçta deterjanın aranacak/sayılacak mikroorganizma üzerine olumsuz etki yapması. Sadece ekimi yapılmamış petri kutuları ve tüpler ile rutin gıda kontrolünde (bozuk gıda ve/veya bozuk olduğundan endişe edilen gıda hariç) kullanılan dilüsyon erlenleri ve tüplerinin 30 dakika içinde olmak kaydı ile sterilize edilmeden yıkanabileceğinin, buna karşı mikroorganizma gelişmesi olmuş malzemenin sterilize edilmeden yıkanmaması veya atılmamasının bilinmemesi. Yanlış inkübasyon sıcaklığı ve/veya süresi seçimi, anaerob koşullarda yapılması gereken inkübasyonda anaerob koşulun sağlandığının kontrol edilmemesi, mikroaerofillerin anaerob ortamda inkübe edilmesi, inkübasyon sırasında anaerob kavanozun kapağının açılarak yeni petri ilave edilmesi ancak yeni bir kimyasal oksijen bağlayıcı poşet konulmaması ve eski poşetin yeterli olacağının sanılması. İnkübatör(ler), pH metre, su banyosu vb. cihazların kalibrasyon hataları, saf su cihazının temizlenmemesi, çalışma atmosferinin ve tezgahların kirli olması. Özellikle sıcak yaz günlerinde laboratuvar havasının sıcak olması nedeni ile ekim sırasında pencerelerin açık bırakılmasına ve/veya laboratuvarda vantilatör çalıştırılmasına bağlı olarak ekimler sırasında besiyerlerinin kontamine edilmesi. Laboratuvarda sadece acil kullanım için her an el altında ancak, günlük kullanılan malzeme deposunda değil, ayrı bir yerde bulunması gereken 3-5 adet steril petri kutusu, 3-5 adet steril boş tüp, yeterli sayılarda ve boyutlarda steril erlen, steril 9 ml ve 90 seyreltme çözeltisi, yeterli miktar ve hacimlerde pipet olmaması ve “her şeyin planlandığı gibi gitmeyeceğinin bilinmemesi” nedeni ile çalışmanın en küçük bir aksamada tümüyle durması. Seyreltmede kullanılacak tüplerin tam 9,0 ml olarak hazırlanması gerektiğinin bilinmemesi ve 10 ml olarak hazırlanması, ya da EMS yönteminden kalan bir alışkanlık ile tüplere 8 – 8,5 ml arasında serum fizyolojik konulması. Baird-Parker Agar besiyerine MUG ilave edilerek aynı besiyerinde E. coli ve Staphylococcus aureus ‘un beraberce sayılabileceğinin sanılması. 05.02. Örnek Hazırlanması ve Ekim Hataları Analize alınacak örneğin uzun bir süre beklemesi, örneğin yetersiz homojenizasyonu, anaeroblar aranacak/sayılacak ise blenderde uzun süreli homojenizasyon sırasında örneğin aşırı oksijenle teması, yanlış çözelti ile seyreltme, seyreltme sırasında bazı tüplerin unutulması ve/veya aynı tüpe iki kez seyreltme yapılması, seyreltme sırasında tüplerin yeterli bir homojenizasyon sağlayacak şekilde karıştırılmaması, seyreltmede pipetleme hataları, dalgınlık ve/veya düzensizlik nedeni ile sterilize edilmemiş pipetlerin ve/veya seyreltme çözeltilerinin kullanılması, seyreltme yapıldıktan sonra ekim öncesi uzun süre beklenmesi, hatalı seyreltme düzeyi seçilmesine bağlı olarak sayım sonucu alınamaması, seyreltmede kullanılan tüplere seyreltme oranlarının yazılmamasına bağlı olarak ekim yapılan petri kutusu üzerine yazılan seyreltme oranı ile ekimin yapıldığı tüpün seyreltme oranının farklı olması, petri kutusuna

Mikrobiyoloji Laboratuvarında Analiz Sonrası İşlemler ( MEGEP )

  • 1. MİKROBİYOLOJİK ATIKLARIN YOK EDİLMESİ

  • 1.1. Otoklavda Sterilizasyon

  • 1.3. Kaplardaki Atıkların Boşaltılması

  • 1.4. Kapların Yıkanması

  • 1.5. Kapların Durulanması

  • 1.6. Kapların Saf Sudan Geçirilmesi

  • 1.7. Mikrobiyolojik Atıkların İmha Edilmesi

  • 2. ÇALIŞMA SONRASI, ARAÇ-GEREÇLERİ ve ORTAMI DEZENFEKTE ETME

  • 2.1. Dezenfeksiyonun Tanımı ve Önemi

  • 2.2. Dezenfektan Maddeler

  • 2.4. Kullanılmış Araç-Gereçleri ve Ortamı Dezenfekte Etme Aşamaları ve Dikkat Edilecek Noktalar

  • 2.5. Çalışma Sonrası Çalışma Alanının Dezenfeksiyonu

  • 2.5.1. Günlük Dezenfeksiyon İşlemleri

  • 2.5.2. Haftalık Dezenfeksiyon İşlemleri