Etiket Arşivleri: HPLC

HPLC Kolonları ve Ayrım Mekanizması ( Suna UÇAN )

HPLC KOLONLARI VE AYRIM MEKANİZMASI

30.08.2016 Suna Uçan

HPLC Kolon Tipleri

                    Kullanımı%
Silica         75
Polymer   20
Alumina   1
Others       4

HPLC Kolonları

different pore sizes, particle sizes and bonding chemistries

Kromasil       100         5          C18

Silika

 Particle shape
 Particle size
 Pore size
 Surface area
 Bonding chemistry

Düzensiz

 Düşük performans ve sağlamlık

 Düşük fiyat – preparatif aplikasyonlarında

Küresel

 Yüksek performans ve sağlamlık

 Yüksek tekrarlanabilirlik

 Kontrol edilebilir homojenlik


Kaynak: http://kromatografi2016.inonu.edu.tr/Kolonlar_ve_Ayrim.pdf

Enstrümental Analiz HPLC-2

ENSTRÜMENTAL ANALİZ HPLC-2

• HPLC dedektörleri
• kolonda birbirinden ayrılan maddeler hareketli faz ile birlikte dedektöre
gelirler. Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir.

HPLC için ideal bir dedektör
• Geniş bir konsantrasyon aralığında yüksek duyarlılığa sahip olmalı
• Düşük gürültü seviyesine sahip olmalı
• Basınç ve sıcaklıktaki değişikliklere de duyarsız olmalıdır.
Gürültü seviyesi: ortamda örnek olmadığında elde edilen pikler. Genellikle
ortamdan sadece su geçirilerek belirlenir. Gürültü seviyesi dedektörün
hassasiyeti hakkında bilgi verir.

• Gürültü (noise) örnekleri

HPLC’de kullanılan dedektörler
• Absorbans Dedektörü
• Floresans Dedektörü
• Refraktif index dedektörü (Kırılma İndisi Dedektörü)
• Elektrokimyasal Dedektör
• İletkenlik Dedektörü

Absorbans dedektörler
• En çok kullanılan dedektörlerden biridir.
• Maddelerin çoğu UV -görünür bölgede çeşitli dalga boylarında absorbansa
sahiptirler. Kantitatif ölçümlerin esası Lambert-Beer yasasına dayanır.
• Absorbans dedektörleri, akış hücrelerinden geçen sıvının sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki- ışığı absorpsiyonunu ölçerler.


Kaynak: http://content.lms.sabis.sakarya.edu.tr/Uploads/49147/28648/enstr%C3%BCmantal_analiz-hplc.pdf

HPLC Kullanım Klavuzu

HPLC KULLANIM KILAVUZU

Sistemin Çalıştırılması

• Sistemler açılır.
• Bilgisayar açılır.
• Pompa üzerinden purge açılarak (Waste Valve), sistem hatları yeni eluent ile hava kalmayacak şekilde akış (1 veya 2 ml/dk) verilir. Gerekirse şırınga ile eluent çekilir.
• Akış sıfırlanır. Purge kapatılır. Kolon için gerekli akış (1 ml/dk) verilir.
• Sistem basıncı sabit olmalı. Basınç çok oynuyorsa sistemde (pompa) hava var demektir. Sistem yeniden purge edilir.
• Yaklaşık 15 dakika sonra sistem analiz yapmaya hazır olur.


Fundamentals of Liquid Chromatography (HPLC)

First, What is Liquid Chromatography?

•  Liquid chromatography is a separation technique that involves:

•  the placement (injection) of a small volume of liquid sample

•  into a tube packed with porous particles (stationary phase)

•  where individual components of the sample are transported along  the packed tube (column) by a liquid moved by gravity.

• The components of the sample are separated from one another by the column packing that involves various chemical and/or physical interactions between their molecules and the packing particles. • The separated components are collected at the exit of this column and identified by an external measurement technique, such as a spectrophotometer that measures the intensity of the color, or by another device that can measure their amount.  F Note: The modern form of liquid chromatography is now referred to   as “flash chromatography”


HPLC’de Karşılaşılan Sorunlar, Nedenleri ve Çözüm Yolları

  1. HPLC’DE KARŞILAŞILAN SORUNLAR, NEDENLERİ VE ÇÖZÜM YOLLARI

HPLC sisteminde karşılaşılan sorunlar genel olarak şu şekilde sıralanabilir;

  1. Basıncın artması

  2. Çözünürlüğün azalması veya düşük ayrım etkisi

  3. Basıncın artması ve ayrım etkisinin azalması

  4. Değişken alıkonma zamanları

  5. Kolonda ayrım işleminin gerçekleşmemesi

  6. Yeni kolon kullanımından kaynaklanan sorunlar

  7. Kolonun ayrım performansının değişiklik göstermesi

  8. Pik çatışması

  9. Kromatogramda uçlanmalar

  10. Kolonun sıkışık doldurulması

  11. Örnek adsorbsiyonu ve solvent kirliliği

  12. Mekanik darbeler

  13. Dolgu maddesinin kimyasal göçü

  14. Dedektör sorunları

  15. Kolon dışı bant genişlemesi

  16. Sistemin hava yapması

  17. Dikkat edilmesi gereken diğer durumlar

1.1. Basıncın Artması

HPLC sisteminde giriş kılcal borularının, kolonun ve dedektör hücresinin tıkanması nedeniyle cihazda karşıt basınç sürekli olarak artmakta ve başlangıç değerini %10 aşmaktadır.

Tıkanıklıklar şu sebeplerden kaynaklanabilir:

  • Mekanik kirlenmeler, pompa contalarında aşınma, enjektör valfındaki rotor pistonunun aşınması,

  • Dökülen tampon tuzlar ve numuneler,

  • Bakteri üremesi ve çözelti içindeki diğer kirlenmeler.

Sorunu gidermek için tıkanmanın olduğu yeri tespit edilmelidir. Bunun için, pompa çalışır halde iken pompa ile detektör arasındaki tüm vida bağlantıları dedektörden başlanarak pompaya doğru sırayla açılır ve burada basıncın belirgin şekilde nerede düştüğü belirlenir. Gerekirse tıkalı kılcal boruları değiştirilmelidir. Şayet sebep süzgeç veya filtreler ise, bunların yenilenmesi veya değiştirilmesi gerekir.

Önleyici tedbirler;

  • Çözeltinin 0,45 µm hassasiyetlikteki tek kullanımlık filtre ile filtrasyonu,

  • Kullanılan organik çözücülerdeki ve çözücü karışımlarındaki tampon tuzların çözünürlükerinin kontrolü,

  • Numunenin filtrasyonu,

  • Ana kolonun korunumu için ön veya koruyucu kolonların kullanımı

1.2. Çözünürlüğün Azalması veya Düşük Ayrım Etkisi

Kolonun güçlü bir şekilde alıkonan bir madde ile kirlenmesi sonucunda çözücü maddenin veya numunenin sebep olabileceği kirlilik unsurlarının numune ile kuvvetli ikincil bir etkileşime girmesi, kolon içindeki kuvvetli basınç darbeleri veya mekanik etkiler ile etkilenen dolgu yatağının dolgu maddesinde kanallar oluşturması ve kolon yatağında çökme meydana gelmesi sonucunda kromatogramlarda elde edilen çözünürlük giderek kötüleşmektedir. Pikler genişlemekte, asimetrik bir şekil almakta ve çift pikler belirmektedir.

Sorunu gidermek için kolon rejenere edilir. Şayet sebep dolgu maddesinin içinde kanal oluşumu ise bunun tamiri mümkün olmadığı için yeni bir kolon kullanılmalıdır.

Önleyici tedbirler;

  • İmkânlar dâhilinde her zaman bir ön kolon veya koruyucu kolon kullanılmalı, böylece kuvvetli şekilde alıkonan bileşiklerin analitik kolona ulaşmalarına mani olunacaktır. Şayet sorun yine ortaya çıkacak olursa, sadece ön veya koruyucu kolonun değiştirilmesi yeterlidir.

  • Kolon, basınç darbelerinden korunmalı ve sistem pompasının akış hızı, istenilen değere ulaşmak için kademeli olarak arttırılmalıdır.

  • Kolon mekanik etki ve darbelerden korunmalı, mümkünse kendi kutusu içerisinde muhafaza edilmelidir.

1.3. Basıncın Artması ve Ayrım Etkisinin Azalması

Optimum pH değerinin aşılması sonucunda silis jeli çözünebilmekte, bu durumda önce daha yüksek bir karşıt basınç üreten küçük parçacıklar, sonra da kolon girişinde bir boşluk oluşur, filtrelenmiş hareketli faz kullandığı halde, basınç birkaç saat içinde sürekli olarak artmaktadır. Böylece kromatogramda bant genişlemesi görülmektedir.

Bu sorunun giderilmesi için yüksek pH değerli çözücülerde doymuş kolonlar kullanılmalıdır. Doymuş kolonlar, pompa ile enjektör arasına kurulan kısa kolonlardır (genellikle ön kolonlar). Çözücü burada kolonun silis jeli ile zenginleşmekte ve ana kolonu korumaktadır. Doymuş kolonun içeriği, ayrıcı kolonda kullanılan dolgu maddesi ile aynı olmaldır. İlaveten ortaya çıkabilecek daha yüksek bir basınç artmasına mani olmak için, doymuş kolon içinde parçacık büyüklüğü daha büyük olan bir dolgu maddesinin kullanımı önerilmektedir.

1.4. Değişken Alıkonma Zamanları

Normal faz kromatografisinde laboratuardaki nem oranına bağlı olarak çözücü yüksek oranda su ihtiva edebilir ve bu da analitin kolondan daha önce ayrılmasına neden olmakta, bunun sonucunda alıkonma zamanları enjeksiyondan enjeksiyona değişkenlik göstermekte ve sürekli olarak azalmaktadır. Başlangıçtaki ayrım elde edilememektedir. Sorunu gidermek için hareketli faz moleküler süzgeç üzerinde kuru tutulmalı ve hareketli faza %1 oranında metanol gibi bir polar değiştirici katılmalıdır.

Ters faz kromatografisinde ise sorun genellikle HPLC pompasındadır. Alıkonma süresinin sürekli olarak azalması, durgun fazın emilim bölgelerindeki bir kaybı akla getirir. Silis jel tabanlı ters fazlarda buna sebep, genellikle hareketli fazın düşük pH (< 2) değerli olmasıdır. Burada silis jeli yüzeyindeki alkil zincirlerinin bağları tahrip olmaktadır. Sorunu gidermek için silis jel tabanlı durgun fazlarda mümkün olduğunca pH 2-8 aralığında çalışılmalıdır. pH < 2 değerlerinde çalışmanız gerekiyorsa, üretici tarafından açık şekilde bu pH aralığında çalışmanız için önerilen durgun fazlar tercih edilmelidir (örn. ChrometiSIL® C18 SH, ChrometiSIL® C18 ace-EPS).

1.5. Kolonda Ayrım İşleminin Gerçekleşmemesi

Muhtemelen yeni metot geliştiriminde kullanılan kolonun yüzey özelliklerini değiştiren bir çözücü kullanılması, kolonun önceden enjekte edilmiş numune parçalarıyla kirlenmiş olması ve kolonun uygun olmayan bir çözücü madde içerisinde depolanması sonucu kolonda karşılaştırılabilir bir ayrım işleminin gerçekleşememesidir.

Sorunu gidermek için seyir defteri tutulmalı, bu deftere kolonların kullanım süresi, kullanılan hareketli faz, kolonun depolandığı çözücü maddeler ve kullanıcılar kaydedilmelidir. Ayrıca metot geliştirimi için mutlaka yeni kolon kullanılmalıdır, durgun faz için yeni nesil (ultra saf) silis jeline dayalı fazlar tercih edilmelidir.

1.6. Yeni Kolon Kullanımından Kaynaklanan Sorunlar

Uzunca bir süre yapılan ayrım işleminin yeni bir kolon kullanılarak yapılmasında, maddelerin seçicilik ve alıkonmalarında olağan özelliklerin dışında belirgin şekilde değişiklikler öne çıkabilmektedir. Sorun mutlaka yeni kolondan kaynaklanmak zorunda değildir. Genelde yeni bir kolona geçildiğinde hareketli faz da değişmektedir.

Sorunu gidermek için, öncelikle HPLC cihazı ve hareketli fazı, “eski” ve eşdeğer özellikte bir kolon ile yeterlilik testine tabii tutularak kontrol edilmelidir. Kullanılan kolon yeterlilik testinin kriterlerini karşılayabiliyorsa, bunu yeni kolon ile değiştirip test yeniden başlatılmalıdır. Yeni kolon gerekli ayrım özelliklerini göstermiyorsa, kolon üreticisi ile iletişime geçilmelidir.

1.7. Kolonun Ayrım Performansının Değişiklik Göstermesi

Kolonun aşırı yüklenmesi sonucu kolonun ayrım etkinliğindeki değişiklik nedeniyle bir enjeksiyonda iyi bir ayrım elde ederken bir diğer enjeksiyonda geniş veya üst üste binmiş piklerin elde edilmesidir. Sorunu gidermek için sorunun aşırı yüklemeden kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak için numune yarı yarıya seyrekleştirilir ve bu şekilde enjeksiyon yapılır. Pikler daralma gösteriyorsa aşırı yükleme vardır. Bir kolonun yüklenebilirliğine ilişkin kabaca şu kurallar geçerlidir:

  • Kütlesel yüklenebilirlik sınırı: 100 µg/g durgun faz

  • Hacimsel yüklenebilirlik sınırı: 50 µl/g durgun faz

1.8. Pik Çatışması

Genellikle çözücü maddenin kuvvetinden ve kolon girişindeki ölü hacimden kaynaklanan sorunlar nedeniyle bileşiklerin alıkonma zamanı daha kısalmakta ve kromatogramdaki piklerin çatışmaktadır.

Bu sorunu gidermek için numune, imkanlar dahilinde çözücülüğü hareketli fazdan az veya ona yakın bir değere sahip çözücü bir maddede çözülmelidir. Sorun ölü hacim oluşması, dolgu maddesinin çökmesi veya yıkanması ise, onarmaya çalışılabilir. Bu az sayıda enjeksiyon için yardımcı olabilir. Fakat kısa bir süre içinde yeni bir kolon temin edilmelidir.

1.9. Kromatogramda Uçlanmalar

Gaz kabarcıkları içeren yani gazı iyi alınmamış çözücü maddeler ile içeriği kurumuş bir kolondan kaynaklanan gaz kabarcıkları kromatogramda uçlanmalara neden olmakta ve değerlendirmeyi güçleştirmektedir. Uçlanmalar sürekli olarak ve düzensiz bir şekilde ortaya çıkmaktadır. Kurumuş kolondaki gaz kabarcıklarının sebebiyet verdiği uçlanmalar oldukça inatçıdır. Tamamen kurumuş bir kolonda bu uçlanmalar, kromatogramda saatlerce görülebilir.

Sorunu gidermek için;

  • Çözücü maddeden kaynaklanan hava kabarcıklarını önlemek için çözücü madde ve bileşimleri kullanımdan önce havadan arındırılmalıdır. Bunun için ideal olanı sisteme gaz alıcı bir ünite bağlamak veya çözücü maddeden sürekli Helyum akışı sağlamaktır.

  • Kolonun kurumasını önlemek için, kolonun kullanılmadığı zamanlarda plastik kapaklar başlıklara vidalanarak kapatılmalıdır. Bir kolonun kuruması, kolon dolgu maddesi iyi doldurulmuşsa kolona bir zarar vermez, ancak kurumanın kromatogramda yol açtığı uçlanmalar kolonun bir süreliğine kullanımına mani olmaktadır.

  • Kurumuş kolonları ilk önce izopropanol ile akıtmak gereklidir. İzopropanol dolgu maddesi yüzeyini nemlendirerek oluşmuş gaz kabarcıklarını da emer.

1.10. Kolonun Sıkışık Doldurulması

Tampon çözeltiler 0,45µm membran filtreler ile süzülürken numuneler 0,20µm’lik membran filtrelerden süzülmelidir. Ayrıca kolon ters olarak bağlanıp düşük bir akış hızında yıkanabilir. Kolon sonu açılıp filtre yıkanabilir ve değiştirilebilir.

1.11. Örnek Adsorbsiyonu ve Solvent Kirliliği

Kolondaki safsızlıklar piklerde tailing olarak adlandırılan kuyruklanmaya neden olurlar. Temel olarak piklerde kuyruklanma nedenleri şu şekilde sıralanabilir:

  • Kolon girişinde kirlilik birikimi

  • Ölü kolon hacmi

  • Derişik örnek enjeksiyonu

  • Analit için uygun olmayan solvent seçimi

  • Silanol gruplarının ve kalıntı ağır metallerin varlığı

Silika jeller serbest silanol (OHˉ) gruplarına sahiptirler. Ortama aktif maddeleri (ODS, C8 vb.) dahil edilmesiyle silika jel apolar hale gelir. Modifiye edilmiş olan silika kolonlar bile yüzeyde serbest silanol grupları içerirler. Silanol grupları amin bileşiklerini absorbe ederler ve kuyruklanmaya neden olurlar. Bu durumda kolonun çözünürlüğü yüksek bir solvent ile yıkanması gerekir. Yıkama için kullanılabilecek en kuvvetli solvent tetrahidro furandır (THF). Bunun yanında asetonitril ile de yıkama yapılabilir. Ayrıca silanol gruplarını etkilerini ortadan kaldırmak için sonu kapalı kolonlar seçilmelidir. Bu kolonlarda trimetilsilil grupları ile muamele edilmelidir. Silika kolonlar normalde safsızlık olarak kalıntı ağır metalleri içerirler. Bu ağır metaller de şelat bileşenleri ile reaksiyona girerek kuyruklanmaya neden olurlar.

1.12. Mekanik Darbeler

Kolonda boşluk oluşumuna neden olmaktadır.  mekanik darbe sadece kolonun yere düşürülmesi olarak değerlendirilmemelidir. Analiz sırasında veya akış sırasında purge valfin açılması da mekanik şoka neden olabilmektedir. Boşluklarda piklerin bölünmesine neden olmaktadır. bunu ise tamiri oldukça zordur.

1.13. Dolgu Maddesinin Kimyasal Göçü

Analiz sırasında kullanılan mobil fazın veya numunenin hazırlandığı solventin özelliklerine (pH, basınç, sıcaklık ve solvent tipi) dikkat edilmelidir. Aksi taktirde kolon direkt olarak zarar görmektedir.

1.14. Dedektör Sorunları

Dedektör hücre hacmini büyük olması pik genişlemesine ve etkinliğin azalmasına neden olur. Pik genişlemesini sınırlamak ve maksimum etkinliği sağlamak için dedektör hücre hacmi minimize edilmelidir.

Noise ve drift, stabil olmayan baseline noise dedektör hücresinde örnek olmaksızın recorder sinyalinde meydan gelen dalgalanma olarak ifade edilebilir. Noise genellikle dedektör ve diğer elektroniklerin parçaları neden olmaktadır. Ayrıca mobil fazdaki değişimler (hava kabarcıkları, akış hızında veya basınçta değişim, sızıntı, safsızlıklar) ve sıcaklık dalgalanmaları da noise neden olmaktadır. Baseline drifti ise HPLC sisteminin ilk açılışında meydana gelmektedir. Eğer sistem ısındıktan sonra drift hale devam ediyor ise, muhtemelen mobil faz kompozisyonunda değişim, sızıntı, sıcaklık dalgalanmaları, kolon kanaması veya dedektör hücresinde hava kabarcığı vardır. Ayrıca yavaş yıkanma nedeniyle bir önceki örnekten kalan komponentler de drifte neden olabilmektedir.

Dedektörlerin her bileşene duyarlılığı aynı değildir. Diğer bir deyişle, her bileşiğin aynı miktarı farklı dedektörlerde aynı şiddette sinyal oluşturmaz. Bu nedenle kullanılan dedektöre ve koşullara göre ölçülen pik alanlarından veya pik yüksekliklerinden bileşik miktarına geçebilmek için, kalibrasyon eğrisinin hazırlanması ve hesaplamanın da ona göre düzenlenmesi gerekmektedir.

1.15. Kolon Dışı Bant Genişlemesi

                  Sıvı kromatografide, kolon dolgusunun dış kısmında bazen önemli bant genişlemesi meydana gelmektedir. Kolon dışı bant genişlemesi olarak adlandırılan bu olay, çözünmüş maddenin enjeksiyon sisteminde bulunan açık borularda, dedektör bölgesinde ve sistemin farklı parçalarını birbirine bağlayan boru bağlantılarında akışı sırasında meydana gelir. Buralarda, borunun merkezindeki ve çeperine yakın bölgedeki sıvı tabakalarının akış hızları arasında farktan dolayı genişleme meydana gelir. Sonuç olarak, çözünen maddenin oluşturduğu bandın merkezi, dış kısımdan daha hızlı hareket eder. Gaz kromatografide kolon dışı genişleme difüzyonla büyük ölçüde engellenir. Ancak sıvılardaki difüzyon büyük ölçüde yavaştır ve bu tip bant genişlemesi çoğu zaman önemsenecek duruma gelir.

            Küçük çaplı kolonlar kolonlar kullanıldığında kolon dışı genişleme oldukça ciddi boyutlara ulaşabilir. Burada kolon bağlantılarının yarıçapını 0,25 mm’nin altına düşürmek için her türlü gayret gösterilmelidir.

1.16. Sistemin Hava Yapması

            Sistemin hava yapmasını önlemenin en kestirme yolu, aygıtın bir parçası olarak gaz giderici satın almaktır.

1.17. Dikkat Edilmesi Gereken Diğer Durumlar

  • Eğer pompada hava varsa, basınç göstergesi aşağı yukarı hareket eder.

  • Sistemin ilk kurulduğunda (yani her şey en iyi durumdayken) aygıta ait tüm verilerin mutlaka kayıt altına alınması gerekir. Çünkü daha sonraki arızalarda bu kayıtların incelenmesi büyük kolaylık sağlayacaktır.

  • Kimi aygıtlarda pompa filtrelerinin temizlenmesi gerekir. Bunun için filtreler sökülür ve İPA (İsopropil alkol) içine atılır ve ultrason banyosuna bırakılır. Genelde 30-45 dakikalık ultrason işlemi temizlik için yeterli olur.

  • Taşıyıcı sıvı haznesinin çıkışındaki filtreye de dikkat edilmelidir. Gerçekte bu filtre diğerlerine göre daha çabuk tıkanır.

  1. UYGULAMALAR SIRASINDA KARŞILAŞILAN SORUNLAR VE ÇÖZÜM YOLLARI

2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Şekerler

            Gıda analizlerinde sık sık fruktoz, glukoz, sakaroz, laktoz ve maltoz analizine ihtiyaç duyulur.

            Düşük molekül ağırlıklı şekerler için örnek hazırlamanın en basit metodu doğrudan sulu ekstraksiyondur. Laboratuarlarda kullanılan bu usul, 65 ˚C’de hızlı ekstraksiyon ve daha sonra asetonitril ile seyreltme ve filtrasyondur. Bu pek çok gıda örneği için iyi bir sonuç verir, fakat iki muhtemel problem vardır. Birincisi, laktoz gibi çözünürlüğü düşük olan bir şekerin asetonitril ilave edildiğinde kısmen çökmesidir. İkincisi, şekerlerden başka sistemde interferense sebep olan pek çok polar komponentin sulu ekstraksiyonla ekstrakte geçebilmesidir. Bu maddeler kolonun ömrünü azaltabilir.

            Ekstraktaki potansiyel interferensleri azaltmak için ekstraksiyonda %80’lik etanol de kullanılabilir. Fakat ilgilenilen bütün şekerlerin yeterli derecede çözündüğünü garanti etmek gerekir. Ekstraksiyon oda sıcaklığında yapılabilir, fakat yüksek sıcaklıklarda geri soğutucu altında yapılması yaygındır. Bu durumda sakarozun inversiyonundan sakınılmalıdır.

            Alternatif bir yaklaşım ilk ekstraksiyondan sonra interferens yapan maddelerin uzaklaştırılmasıdır. Bunu başarmanın birçok yolu vardır. Eğer ekstrat alkolik bir çözelti ile hazırlanmışsa, ekstratta lipidler bulunacaktır. Bu kloroform gibi alkolle karışmayan bir sıvı ilavesiyle ortadan kaldırılabilir. Carrez solüsyonu veya kurşun asetat gibi ağartma eczalarının ilavesi, polisakkaritler, proteinler gibi büyük çözünür moleküllerin ortadan kaldırılması için faydalı olabilir. Bu, şeker kompozisyonunu değiştiren enzim aktivitesi örnekte mevcutsa, özellikle önemlidir. Bu durumda herhangi bir ısıtma uygulamadan önce eczalar ilave edilmiş olmalıdır. Alternatif olarak sodyum azid veya gümüş nitrat gibi bir madde enzimi inaktif yapmak için ilave edilebilir.

            Aminoasitler ve organik asitler gibi küçük molekül ağırlığı kirleticilerin uzaklaştırılması için karışık yatay iyon değiştirme reçineleri faydalıdır. Bu ekseriya şarap, meyve, meyve suyu analizlerinde uygulanır, fakat şekerlerin reçine tarafından alıkonulmadığından emin olmak gerekir. Sep-Pak kartuşlar gibi küçük zıt-faz kartuşlar gibi küçük zıt-faz kolonlar, arzu edilmeyen kontaminantları uzaklaştırmada kullanılabilir. Ekstrat katı partiküllerden arındırılmış olmalıdır. Bu nedenle gerekliyse filtre edilir.

            Düşük molekül ağırlıklı şekerler için amino bağlı silika kolonların kullanıldığı analizlerde 15-25 cm kolon uzunluğu ve %70-80 asetonitril içeren sulu bir mobil faz kullanmak gerekir. Dedeksiyon RI dedektörle yapılır. Enjeksiyon miktarı genellikle 10-100 μl’dir. Glukoz-galaktoz arasındaki zayıf rezolüsyon RI dedektörün kullanım sınırını tayin eder. Dereceli elüsyona izin veren bir dedektör ve dereceli elüsyon sistemi kullanılarak iki şeker arasındaki separasyon ıslah edilebilir.

            Silika kolonda ayrılmaları zor olan glukoz-galaktoz birbirinden katyon değiştirme kolonunda kolaylıkla ayrılabilir.

2.2. Oligosakkaritler  

            Buğday veya mısır nişastasının asidik veya enzimatik parçalanması sonucu meydana gelen glukoz polimerlerini içeren şurubun analizi HPLC ile yapılabilir.

            Oligosakkaritleri analiz etmek için uygulanan iyon-değiştirme metodları genellikle karbonhidrat materyalinin hepsini elute eder, fakat 10 glukoz ünitesinden daha büyük olanları ayıramaz. Aksine, amino bağlı silika kolonlar dereceli elüsyona izin veren bir dedektör kullanılması halinde en az 18 glukoz ünitesine kadar ayrılabilir. Pulsed amperometrik dedektör kullanılan anyon-değiştirme metodu 22 glukoz inütesine kadar ayırım göstermektedir, fakat dedektör duyarlılığı için molar düzeyde konsantrasyon gereklidir.

            Oligosakkarit analizleri için kullanılan metodlar düşük molekül ağırlıklı şekerlerinkine benzer. Aynı amino kolonlar kullanılır, fakat mobil fazdaki su yüzdesi %40-60 arasındadır. Analiz süreleri daha uzundur. Kullanılan katyon değiştirme reçineleri benzerdir, fakat farklı zıt iyona sahiptirler. Bu amaçla kalsiyum ve gümüş yaygın bir şekilde kullanılırlar. Separasyon gücü kolonlar seri bağlanılarak arttırılabilir.

            Diğer bir uygulama alanı, amiloz ve amilopektin gibi nişasta fraksiyonlarına ilişkindir. Bu sistemler sert jel filtrasyon kolonları kullanılırlar. Çözünürlük problemleri yüzünden mobil faz olarak dimetilsülfoksid kullanılır. İyi bir rezolüsyon elde etmek için 0,3 ml/dak gibi düşük akış hızları gereklidir. Komponentlerin hepsi bir kolon hacminde elute olurlar.

KAYNAKÇA

  1. Gündüz, T., (1997) Kantitatif Analiz Laboratuar Kitabı, Bilge Yayıncılık, Ankara.

  2. Hışıl, Y., (1994) Enstrumental Gıda Analizleri, Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Bornova İzmir.

  3. Yetim, H., ve Çam, M., (2009) Enstrumental Gıda Analizleri, Erciyes Üniversitesi Yayınları, Kayseri.

  4. Yıldırm, Z., (2000) Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi, Ankara İl Kontrol Laboratuar Müdürlüğü.

  5. Anonim (2010), http://www.tarimsal.com/laboratuvarkurmak.html, erşim tarihi 15.04.2010

HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ( Arş.Gör. Nahit GENÇER )

HPLC

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
HPLC Nedir?
HPLC’nin Kısımları:
Hareketli Faz Rezervuarı
Pompa Sistemi
Numune enjeksiyon Sistemi
Kolon
Dedektör
HPLC Çeşitleri
HPLC Uygulamaları

HPLC

Yüksek performans sıvı kromotografisi (High Performance Liquid Chromatography : HPLC) ; en yaygın olarak kullanılan analitik tekniklerden bir tanesidir.
Kromatografik prosesler, durgun ve hareketli fazlar arasında kütle transferini kapsayan ayırma teknikleri olarak tanımlanırlar.
HPLC; bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler ilk olarak çözgende çözünürleştirilirler ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar.
Başlangıçta basınç; modern sıvı kromatografisinin temel kriteri olarak düşünülmekteydi ve bu nedenle “Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi” olarak adlandırılmaktaydı.
Ancak bu günümüzde geçersiz kabul edilmektedir. Çünkü yüksek performans yalnız basıncın değil bir çok faktörün birleşmesiyle ortaya çıkmaktadır.

Bu faktörler ;
-Dar bir dağılım aralığında çok küçük partiküllerin kullanılması,
– Uniform gözenek boyutu ve dağılımı,
– Yüksek basınçta kolon paketleme,
– Doğru, düşük hacimli örnek enjektörleri,
– Duyarlı dedöktörler,
– İyi pompalama sistemi kullanımı,

olarak sınıflandırılır. Bu nedenlerden dolayı Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi terimi kullanılmaktadır.

HPLC’nın diğer klasik tekniklerle kıyaslandığında;

Küçük boyutlu paslanmaz çelik kolonların kullanılması,
Partikül boyutları çok küçük (3,5-10 mm) matrikslerin kullanılması,
Yüksek iç basınç ve kontrollü akış hızı sağlanabilmesi,
Örnek gereksinimlerinin az olması,
Sürekli akış dedektörleri ile küçük miktarların tayinine olanak sağlaması,
Otomasyona müsait olması,
Hızlı analiz imkanı ve yüksek ayırma gücüne sahip olması
nedeniyle çok yönlü uygulamalara daha açık olduğu görülmektedir.
Bu gelişmelerin; adsorbsiyon, dağılım, iyon değişim, moleküler elek ve affinite kromatografi tekniklerine de yansımasıyla hızlı ve daha iyi ayrım gücü sağlanmıştır.

HPLC’nın KISIMLARI

HPLC aletleri genelde;
hareketli faz rezervuarı,
pompa,
enjektör,
kolon,
dedektör ve kaydedici (veya veri sistemi) içerirler.

Ayırma kolonda gerçekleşir.Durgun faz mm boyutlu poröz partiküllerden oluşur, bu nedenle hareketli fazın kolondan geçişi için yüksek basınç pompalarına ihtiyaç vardır.
Kromatografik proses kolona örneğin enjeksiyonu ile başlar.
Bileşenlerin ayrılması analit ve hareketli fazın kolona pompalanması ile devam eder.
Ayrılarak elue olan her bir kompenentin pikleri kaydedilir.
Her bir komponent için alınan dedektör cevabı bir kaydedici veya bilgisayar ekranında kromotogram olarak görüntülenir.

1- Hareketli Faz Kapları ve Çözücü Muamele Sistemleri

Modern bir HPLC cihazında bir veya daha çok cam veya paslanmaz çelik kaplar bulunur. Bunların her biri 500 mL’den daha fazla çözücü alacak kapasiteye sahiptir.
Sistemde kullanılan hareketli fazın seçimi uygulanan ayırma tipine bağlıdır. Bu nedenle sulu tamponlardan hidrokarbonlara kadar farklı polaritede çözücüler kullanılır. HPLC sistemlerinde kullanılacak tüm çözgenler çok saf olmalıdır. İz miktardaki safsızlıklar kolonu etkileyerek dedeksiyon sisteminde girişime neden olabilirler.
Tüm solventlerin gazının alınması (degassing) zorunludur, aksi taktirde çözgende hava kabarcıklarının bulunması pompa ve kolonda problemlere neden olmaktadır. (Örneğin; kolonda kabarcık oluşturarak pik genişlemesine yol açar.)
Gazın alınması farklı şekillerde gerçekleştirilebilir; solventlerin ısıtılması, karıştırarak vakuma maruz bırakma, ultra sonifikasyon veya çözgen rezervuarına helyum gazı verilmesi.
Sonuç olarak hareketli fazda bulunması gereken özellikler; saflık, dedektöre uyumluluk, örneğin çözünürlüğü, düşük viskozite, kimyasal inertlik ve uygun fiyat olarak sıralayabiliriz.
Hareketli faz , örnek ve sabit faz arasındaki etkileşimlerin ayarlanabilmesi için değiştirilmektedir.
Hareketli faz tipleri; izokratik, gradiyent ve politipik olmak üzere üç formda uygulanabilir.
İzokratik elüsyonda bileşenler sabit bileşimli tek bir çözücü ile elüe edilirler. Tüm bileşenler kolonda aynı anda, farklı hızlarda göç ederler.
Gradiyenet elüsyon; polarlıkları birbirinden farklı iki (veya bazen daha fazla) çözücü sistemlerinin kullanıldığı tekniktir. Çözücü bileşimi sürekli veya basamaklı olarak değiştirilir.
Politipik hareketli faz, karışık tip kromatografilerde tercih edilebilir. Aynı kolonu kullanarak birçok kromatografik teknik için uygulanabilir.
Pompa sistemleri
HPLC pompası, sıvı kromatografi sisteminin en önemli kısımlarından bir tanesidir. Sistemde; elüent’in; enjektör, kolon ve dedektör boyunca sürekli sabit akışını sağlayan kısımdır.

HPLC analizlerinde kullanılan bir çok tip pompa mevcuttur. Bunlar; Emme Basma Piston Pompalar, Şırınga Tipi Pompalar ve Sabit Basınç Pompalarıdır.
Sıvı kromatografide kullanılan pompaların şu özellikleri bulunmalıdır:

– 5000 psi (1b/in2) ye kadar basınçlar oluşturabilmeli,
– Pulssuz sıvı çıkışı bulunmalı
– Akış hızı 0,1’den 10mL/dakika’ya kadar ayarlanabilmeli,
– Sıvı akış hızlarının tekrarlanabilirliği %0,5 veya daha iyi olmalı,
– Çok sayıda çözücünün korozyon etkisine karşı dayanıklı olmalıdır.

Numune Enjeksiyon Sistemi

Örnekler; HPLC’ye enjeksiyon ünitesinden enjekte edilir. Enjeksiyon ünitesi basit olarak bir enjeksiyon valfi ve örnek haznesinden oluşur.
Örnek Enjeksiyon öncesi hareketli fazda çözülerek bir şırınga ile valften enjekte edilir.
Kolon

HPLC’de kullanılan ayırma kolonları genellikle paslanmaz çelik olup yüksek basınçlara dayanıklıdır. Sıklıkla kullanılan kolonlar 4.5-5.0 mm iç çaplı ve 10-30 cm uzunluğundaki kolonlardır. Ancak araştırmanın ihtiyacına göre çok farklı boyutlarda kolonları ticari firmalardan temin etmek mümkündür.
Durgun Faz;

Kolon Dolgu Materyali:

HPLC durgun fazı kolon içindeki katı destek maddesidir. Örnek solüsyonunun, kolona enjeksiyonu ile non-kovalent etkileşim olmaksızın durgun fazda bileşenlerin göçü söz konusudur.
Durgun faz ve örneğin hareketli faz ile kimyasal etkileşimleri, göç derecesi ve örnek bileşenlerin ayrılmasını belirler.
Uygulanacak kromatografi türünün prensibine göre kolon dolgu maddeleri farklıdır. (Kromatografi tipleri; sıvı-katı adsorpsiyon, normal faz, zıt- faz, iyon değişimi vb.)
Kolon dolgu materyalleri genellikle silika ve alümina esaslıdır; gözenekli (poröz), küresel spherical), düzensiz (irregular), pelliküler (pellicular) ve mikro tiplerinde olmaktadır.
Dolgu maddesinin seçiminde tanecik biçimi, büyüklüğü, tanecik büyüklüğünün dağılımı, gözenek hacmi ve yüzey alanı gibi özellikler rol oynar. Yapılacak çalışmanın cinsine göre seçim yapılmalıdır.

Kolonların doldurulması

HPLC kolonları; değişik dolgu materyali yapılarında ve boyutlarda ticari firmalardan temin edilebilirler. Ancak birçok araştırıcı ucuz olması nedeniyle kendi kolonlarını doldurmayı tercih eder. Kolon doldurulmasında kullanılacak metot, dolgu materyalinin tabiatına ve partikül büyüklüğüne bağlıdır.

Dedektör

Dedektörler, kolondan elüe olan örnek bileşeninden alınan cevap doğrultusunda sinyallerin kromatogram üzerinde pik olarak ifade edilmesini sağlayan alettir. Dedektörler kolon sonrasına monte edilir.
HPLC için ideal bir dedektör; geniş konsantrasyon aralığında; yüksek duyarlılığa, düşük gürültü seviyesine, bilinen seçiciliğe sahip olmalı ve kromatografik rezolüsyona kötü etki yapmaksızın kolon akıntısındaki bileşiklere duyarlı olmalıdır. Böyle bir dedektör sıcaklık ve basınçtaki değişmelere de duyarsız olmalıdır.
Kullanılacak dedektör sistemi, analizi yapılacak numunenin cinsine uygun olmalıdır.
Sıvı kromatografisinde en çok kullanılan dedektörler, ultraviyole veya görünür ışığın absorpsiyonuna dayanırlar.

HPLC ÇEŞİTLERİ

Sıvı kolon kromatografisinin sınıflandırılması durgun faz ve ayırma prosesinin tabiatı üzerine yapılıyorsa bu durumda dört sınıftan bahsedilebilir.

1) İyon değişim kromatografisi
2) Moleküler elek kromatografisi (Jel Filtrasyon)
3) Affinite kromatografisi
4) Adsorbsiyon kromatografisi
Normal Faz Kromatografisi Ters Faz Kromatografisiâ
RP-HPLC (Ters Faz Kromatografisi) :

Çok sayıda organik bileşiği ayırabilme yeteneğinden dolayı tercihen sıklıkla kullanılan HPLC türüdür. Durgun faz apolardır, hareketli faz ise polar bir sıvıdır. Apolar materyallerin kolonda tutulması söz konusudur.

HPLC UYGULAMALARI

Preparatif HPLC, bileşiklerin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılır.
Kimyasal ayırmalar, bir kolon ve hareketli fazda bileşiklerin farklı güç hızlarına göre ayrılması temeline dayanır.
Saflaştırma; hedef bileşiğin diğer bileşikler veya kontaminantlardan ayrılması ve ekstraksiyonudur. Her bir bileşik belirli kromatografik koşullar altında karakteristik bir pike sahiptir. Ayrılması istenen bileşenin ihtiyaçlarına göre araştırıcının koşulları optimize etmesi gerekmektedir.
HPLC ile bileşiklerin identifikasyonu yapılır.
Miktar tayini; konsantrasyonu bilinmeyen bir örneğin solüsyonda tayin edilmesi; genelde örneğin standart çözeltisinin bilinen farklı miktarlarının kolona verilmesi ve elde edilen değerlerin korelasyonunun yapılması ile mümkün olabilmektedir. Genelde korelasyon pik alanları veya pik yüksekliklerinin kullanılması ile yapılır.
Yüksek Performanslı Dağılım Kromatografisinin Tipik Uygulamaları

High Performance Liquid Chromatography ( Dr.Hüseyin BOZKURT )

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is one mode of chromatography, the most widely used analytical technique. Chromatographic processes can be defined as separation techniques involving mass-transfer between stationary and mobile phases. Present day liquid chromatography that generally utilizes very small packing particles and a relatively high pressure is referred to as high performance liquid chromatography (HPLC).

HPLC utilizes a liquid mobile phase to separate the components of a mixture. These components are first dissolved in a solvent, and then forced to flow through a chromatographic column under high pressure. In the column, the mixture is resolved into its components. The amount of resolution is important, and is dependent upon the extent of interaction between the solute componentsand the stationary phase. The stationary phase is defined as the immobile packing material in the column. The interaction of the solute with mobile and stationary phases can be manipulated through different choices of both solvents and stationary phases. As a result, HPLC acquires a high degree of versatility not found in other chromatographic systems and has the ability to easily separate a wide variety of chemical mixtures.

HPLC: Separation And Quantification Of Components In Diet Soft Drinks

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY:

Separation And Quantification

Of Components In Diet Soft Drinks

REFERENCES:

1.      Principles of Instrumental Analysis, 5th Edition, Douglas Skoog, F. James Holler, Timothy Nieman, Saunders College Publishing, Philadelphia, 1998.

2.      “The Analysis of Artificial Sweeteners and Additives in Beverages by HPLC,” Journal of Chemical Education, vol. 68(8), August 1991, p A195-A200.

OBJECTIVES: 

The purpose of this experiment is to quantify the caffeine content of a diet cola sample using high performance liquid chromatography (HPLC).  In order to quantify the caffeine, it must be isolated from the other components in the mixture.  In this experiment, you will determine a set of HPLC conditions suitable for separating caffeine, benzoic acid, and aspartame and then quantify the caffeine content of your cola sample using a standard calibration curve.  At the end of this experiment you should understand the mechanisms by which components in a mixture are separated, identified, and quantified using HPLC and understand how to vary experimental parameters to optimize a separation.

BACKGROUND:

The fundamentals of chromatographic separations and a detailed discussion of the application of HPLC are covered in reference 1 (chapters 26 and 28).  The following discussion summarizes important concepts from these chapters, but the student is encouraged to read the full text.

Introduction to HPLC and Instrument Components.

High performance liquid chromatography (HPLC) is an important analytical tool for separating and quantifying components in complex liquid mixtures.  By choosing the appropriate equipment (i.e. column and detector), this method is applicable to samples with components ranging from small organic and inorganic molecules and ions to polymers and proteins with high molecular weights.  The various types of HPLC and their characteristics are summarized in the table below.  In this experiment, we will use reversed-phase partition chromatography.

Table 1.  Various Types and Applications of HPLC 

TYPE

SAMPLE POLARITY

MOLECULAR WEIGHT RANGE

STATIONARY PHASE

MOBILE PHASE

Adsorption

non-polar to somewhat polar

100 – 104

silica or alumina

non-polar to polar

Partition (reversed-phase)

non-polar to somewhat polar

100 – 104

non-polar liquid adsorbed or chemically bonded to the packing material

relatively polar

Partition (normal-phase)

somewhat polar to highly polar

100 – 104

highly polar liquid adsorbed or chemically bonded to the packing material

relatively non-polar

Ion Exchange

highly polar to ionic

100 – 104

ion-exchange resins made of insoluble, high-molecular weight solids functionalized typically with sulfonic acid (cationic exchange) or amine (anionic exchange) groups

aqueous buffers with added organic solvents to moderate solvent strength

Size-Exclusion

non-polar to ionic

103 – 106

small, porous, silica or polymeric particles

polar to non-polar

Figure 1.  shows the components of our Hewlett-Packard Model 1100 HPLC.  The system consists of:

·         reservoirs to hold the solvents used to make up the mobile phase

·         a solvent degasser to prevent bubbles in the mobile phase

·         a programmable quaternary pump that mixes the solvents in the prescribed ratios and pumps them through the column and past the detector

·         a column compartment that houses and thermostats the HPLC column

(in our case a ZORBAX, reversed-phase C18 column; dimensions 4.6mm x 15 cm)

·         an autosampler that draws prescribed volumes from sample vials and injects them onto the column

·         a diode array detector that monitors the entire UV-vis spectrum of the column effluent at regular intervals

Control of the above components and data acquisition and analysis are performed on a personal computer. 

Figure 1.  HPLC 1100 Instrument Components

Optimization of Resolution and Column Performance.

The goal of any HPLC experiment is to achieve the desired separation in the shortest possible time.  Time is critical because “time is money” and because as we’ll see, the more time the sample spends on the column, the more the bands containing the components spread, resulting in reduced resolution.  Optimization of the experiment thus usually involves manipulation of column and mobile phase parameters to alter the relative migration rates of the components in the mixture and to reduce zone broadening.  These can generally be optimized fairly independently.

Migration Rates

The length of time it takes for a given component/solute to travel through the column and be detected is determined by the flow rate of the mobile phase, m, and the partitioning of the solute between the mobile and stationary phases.  Since the solute molecules can only travel when they are dissolved in the mobile phase, the greater their concentration in the mobile phase, the faster they will elute.  The partition coefficient, K, is defined in equation 1

where CS is the concentration of the solute dissolved in or adsorbed to the stationary phase, and CM is the concentration of the solute in the mobile phase. 

The quantities CS and CM, however, are rarely determined in chromatographic experiments.  Instead, a quantity called the retention factor, k’, is determined.  The retention factor for a component A is defined as

where tR is the retention time of component A and tM is the retention time of an unretained species (also called the dead time).  The average rate of linear migration of component A is related to both the flow rate of the mobile phase and the retention factor. 

The retention factors should normally lie in a range of 2-5, but for complex mixtures a larger range may be required to separate all the components.  The value of the retention factor for a given component depends on the chemical identity of the component and the following experimental variables:

·         mobile phase flow rate

·         mobile phase composition

·         column temperature

·         column composition

Zone Broadening

The extent to which the component bands spread as they travel down the column affects the efficiency of the separation.  The theoretical plate height, H, is defined in equation 4 and is based on a Gaussian analysis of the peak width, s, as it exits the column at point L.

where

and W is the width of the peak at the base.  The data analysis program on our HPLC actually reports the width at half maximum, W1/2, for each peak rather than the width at the base.  Assuming a Gaussian peak shape,

so,

The number of theoretical plates in the column, N, is

Efficient columns have small H and large N for a given component.  The theoretical plate height is affected by the following experimental parameters:

·         mobile phase flow rate

·         diffusion coefficient of the solute in the mobile phase

·         diffusion coefficient in the stationary phase (depends on temperature and viscosity)

·         retention factor

·         diameter of the particles packing the column

·         thickness of the liquid coating on the stationary phase

Resolution

The resolution of two adjacent peaks, RS, is determined by their separation and their widths.

In other words, RS depends on both migration rates and zone broadening.  A resolution of 1.5 means that the overlap of the peaks is about 0.3%, so conditions should be optimized to achieve at least this resolution if possible. 

In this experiment, you will adjust only the composition of the mobile phase to optimize the retention factors and resolution.  We will not attempt to optimize the zone broadening independently by changing the column or the flow rate.

Components in Diet Soft Drinks

            The ingredient list for most diet soft-drinks includes caffeine, benzoic acid, and aspartame (Nutrasweet®).  The structures of these compounds are shown below along with their UV-vis spectra. 

Caffeine

C8H10N4O2

MW = 194.19

pKa = 10.4

Benzoic Acid

Aspartame

EXPERIMENTAL PROCEDURE:

Solutions:

Provided by instructor:

mobile phase  –           HPLC-grade methanol

                                   20 mM phosphate buffer, pH 3

standard samples  –     mixture containing caffeine, aspartame, benzoic acid and uracil

                              –     individual samples of each of the above components        

Student prepared:

diet cola sample –        degassed for 20 minutes with air stream followed by filtration with 0.22mm syringe filter

caffeine standards –    100% = 0.045g/250 mL water

                                    85% dilution

                                    70%

                                    65%

                                    50%

                                    (and additional dilutions as necessary to bracket cola sample)

Equipment:

Model 1100 Hewlett-Packard HPLC system

ZORBAX reversed-phase bonded C18 HPLC column (4.6 mm x 15 cm)

250mL volumetric flask

40-200 mL automatic pipet

200-1000 mL automatic pipet

1mL HPLC vials with caps

vial crimper

analytical balance

Notes on Use of HPLC:

·         Your instructor will show you how to use the equipment and the software.  A primer guide/refresher is also found in the appendix.

·         At the beginning of the day, first open the valve with the black knob on the front of the pump manifold.  This sends the mobile phase to waste instead of the column.  Allow the pump to run for about 10 minutes at 5 mL/min to purge the lines of any air bubbles.

·         At the end of the day, run an 80% water/20% methanol mixture through the column at 1 mL/min for 10 minutes followed by 100% methanol for 10 minutes.  This should flush the column of any potential salt forming materials and stores the column in a compatible solvent.

Sequence of Analysis:

1.      Determine optimum conditions for separation of caffeine, benzoic acid and aspartame using the standard sample provided.  Start with a 75% buffer/25% methanol mobile phase mixture at 1 mL/min, 1mL injection volumes, and a 20 minute run time.  Uracil has been added to the standard mixture to provide a dead time marker (i.e. uracil is unretained).  The diode array detector can monitor several wavelengths at once as well as record the entire spectrum at specified intervals.  Use the UV-vis spectra of the components shown above to choose appropriate wavelength(s) to monitor the chromatograms.  Vary the ratio of buffer to methanol to achieve an acceptable separation and finally adjust the run time to end after the last component exits the column.  Use these data to calculate the retention factors for each component, the resolution between each pair of adjacent peaks, and the values for H and N for caffeine under these conditions.

2.      Using the conditions determined above and the pure samples of each component provided, determine the retention time of each component (i.e. identify the peaks).

3.      Using the column conditions determined above and 5mL injection volumes, run three samples of your most concentrated caffeine standard to determine the precision of the injections.  Then run the remaining caffeine standards and the diet cola sample to determine the concentration of caffeine in your sample using a calibration curve.  Check the full spectrum of each peak against spectra of the pure components to verify that the peaks represent isolated components.

APPENDIX:  SETTING HPLC PARAMETERS
The chemstation control software is accessed via the start menu, programs, HP Chem Stations, and then instrument 1 online.  All of the components are controlled via the run control window shown below by accessing the instrument sub-menus for each of the components.  Notice also that the status of each component is indicated on the run control screen.

The parameters are set in the various “set” menus.  The “more” menus contain control sub-menus that allow you to actually turn these components on.

You can either run individual samples one at a time using the Run Method command under the Run Control menu, or run a sequence of samples using the Sequence menu and it’s various sub-menus.  If you choose the run method option, use the Sample Info menu under the Run Control menu to tell the computer where to store your files and what to name each run.  If you use the sequence mode, you can enter this information in the sequence parameters sub-menu.

Once the data has been collected, use the View menu to see the report containing the chromatograms at each monitored wavelength and the integrated peak areas etc.  From here you can print the report as well as view and print full spectra at any peak.

HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY:

SEPARATION AND QUANTIFICATION

OF COMPONENTS IN DIET SOFT DRINKS 

NAME ________________________________                          DATE ______________

Solutions:

Mass caffeine   _____________

Dilution volumes:       standard    /      water

                       A:        _______  /  _________

                       B:        _______  /  _________

                       C:        _______  /  _________

                       D:        _______  /  _________

                       E:        _______  /  _________

Optimization of Conditions:

% buffer                     ____________

% methanol                ____________

flow rate                     ____________

column pressure         ____________

 

Retention Time (min)

Retention Factor (k’)

W1/2

Uracil

 

 

 

Caffeine

 

 

 

Aspartame

 

 

 

Benzoic Acid

 

 

 

Rcaffeine,aspartame  _______________

Hcaffeine  ___________________

Ncaffeine  ___________________

Quantitation of Caffeine:

wavelength chosen for quantitation  __________________

Sample

[caffeine] (mg/L)

Peak Area

A    
     
     
B    
C    
D    
E    
diet cola    

avg. peak area for A  ____________________  95% CIm  __________________

slope   ___________________

std. dev. slope  _________________        95%CI slope   ____________________

intercept  ___________________

std. dev. intercept  _______________      95%CI intercept   __________________

R2  ________________

covariance  ___________________

[caffeine]diet cola  _____________________  95%CI  ____________________

Discussion Questions:

Discuss how the choice of monitored wavelength affects the sensitivity of the analysis.  Would you choose the same wavelength to quantify benzoic acid or aspartame?

Based on the pKa’s of the components in our samples, why do you think a mobile phase buffer of pH 3 was chosen? 

If significant zone broadening had resulted in unsatisfactory resolution in our experiment, what might we have changed to reduce its affect?  Comment on the feasibility of this.

Compare the precision obtained for the three injections of the same sample to the precision of your calibration curve.  Which limits the precision of your unknown concentration?  Would using an internal standard be justified?

Show sample calculations and attach all relevant chromatograms and spreadsheet printouts.