Etiket Arşivleri: HPLC

HPLC Kolonları ve Ayrım Mekanizması ( Suna UÇAN )

HPLC KOLONLARI VE AYRIM MEKANİZMASI

30.08.2016 Suna Uçan

HPLC Kolon Tipleri

                    Kullanımı%
Silica         75
Polymer   20
Alumina   1
Others       4

HPLC Kolonları

different pore sizes, particle sizes and bonding chemistries

Kromasil       100         5          C18

Silika

 Particle shape
 Particle size
 Pore size
 Surface area
 Bonding chemistry

Düzensiz

 Düşük performans ve sağlamlık

 Düşük fiyat – preparatif aplikasyonlarında

Küresel

 Yüksek performans ve sağlamlık

 Yüksek tekrarlanabilirlik

 Kontrol edilebilir homojenlik


Kaynak: http://kromatografi2016.inonu.edu.tr/Kolonlar_ve_Ayrim.pdf

Enstrümental Analiz HPLC-2

ENSTRÜMENTAL ANALİZ HPLC-2

• HPLC dedektörleri
• kolonda birbirinden ayrılan maddeler hareketli faz ile birlikte dedektöre
gelirler. Dedektör maddenin derişimi ile doğru orantılı bir özelliğini ölçmelidir.

HPLC için ideal bir dedektör
• Geniş bir konsantrasyon aralığında yüksek duyarlılığa sahip olmalı
• Düşük gürültü seviyesine sahip olmalı
• Basınç ve sıcaklıktaki değişikliklere de duyarsız olmalıdır.
Gürültü seviyesi: ortamda örnek olmadığında elde edilen pikler. Genellikle
ortamdan sadece su geçirilerek belirlenir. Gürültü seviyesi dedektörün
hassasiyeti hakkında bilgi verir.

• Gürültü (noise) örnekleri

HPLC’de kullanılan dedektörler
• Absorbans Dedektörü
• Floresans Dedektörü
• Refraktif index dedektörü (Kırılma İndisi Dedektörü)
• Elektrokimyasal Dedektör
• İletkenlik Dedektörü

Absorbans dedektörler
• En çok kullanılan dedektörlerden biridir.
• Maddelerin çoğu UV -görünür bölgede çeşitli dalga boylarında absorbansa
sahiptirler. Kantitatif ölçümlerin esası Lambert-Beer yasasına dayanır.
• Absorbans dedektörleri, akış hücrelerinden geçen sıvının sabit ya da istenilen değere ayarlanabilir dalga boyundaki- ışığı absorpsiyonunu ölçerler.


Kaynak: http://content.lms.sabis.sakarya.edu.tr/Uploads/49147/28648/enstr%C3%BCmantal_analiz-hplc.pdf

HPLC Kullanım Klavuzu

HPLC KULLANIM KILAVUZU

Sistemin Çalıştırılması

• Sistemler açılır.
• Bilgisayar açılır.
• Pompa üzerinden purge açılarak (Waste Valve), sistem hatları yeni eluent ile hava kalmayacak şekilde akış (1 veya 2 ml/dk) verilir. Gerekirse şırınga ile eluent çekilir.
• Akış sıfırlanır. Purge kapatılır. Kolon için gerekli akış (1 ml/dk) verilir.
• Sistem basıncı sabit olmalı. Basınç çok oynuyorsa sistemde (pompa) hava var demektir. Sistem yeniden purge edilir.
• Yaklaşık 15 dakika sonra sistem analiz yapmaya hazır olur.


Fundamentals of Liquid Chromatography (HPLC)

First, What is Liquid Chromatography?

•  Liquid chromatography is a separation technique that involves:

•  the placement (injection) of a small volume of liquid sample

•  into a tube packed with porous particles (stationary phase)

•  where individual components of the sample are transported along  the packed tube (column) by a liquid moved by gravity.

• The components of the sample are separated from one another by the column packing that involves various chemical and/or physical interactions between their molecules and the packing particles. • The separated components are collected at the exit of this column and identified by an external measurement technique, such as a spectrophotometer that measures the intensity of the color, or by another device that can measure their amount.  F Note: The modern form of liquid chromatography is now referred to   as “flash chromatography”


HPLC’de Karşılaşılan Sorunlar, Nedenleri ve Çözüm Yolları

  1. HPLC’DE KARŞILAŞILAN SORUNLAR, NEDENLERİ VE ÇÖZÜM YOLLARI

HPLC sisteminde karşılaşılan sorunlar genel olarak şu şekilde sıralanabilir;

  1. Basıncın artması

  2. Çözünürlüğün azalması veya düşük ayrım etkisi

  3. Basıncın artması ve ayrım etkisinin azalması

  4. Değişken alıkonma zamanları

  5. Kolonda ayrım işleminin gerçekleşmemesi

  6. Yeni kolon kullanımından kaynaklanan sorunlar

  7. Kolonun ayrım performansının değişiklik göstermesi

  8. Pik çatışması

  9. Kromatogramda uçlanmalar

  10. Kolonun sıkışık doldurulması

  11. Örnek adsorbsiyonu ve solvent kirliliği

  12. Mekanik darbeler

  13. Dolgu maddesinin kimyasal göçü

  14. Dedektör sorunları

  15. Kolon dışı bant genişlemesi

  16. Sistemin hava yapması

  17. Dikkat edilmesi gereken diğer durumlar

1.1. Basıncın Artması

HPLC sisteminde giriş kılcal borularının, kolonun ve dedektör hücresinin tıkanması nedeniyle cihazda karşıt basınç sürekli olarak artmakta ve başlangıç değerini %10 aşmaktadır.

Tıkanıklıklar şu sebeplerden kaynaklanabilir:

  • Mekanik kirlenmeler, pompa contalarında aşınma, enjektör valfındaki rotor pistonunun aşınması,

  • Dökülen tampon tuzlar ve numuneler,

  • Bakteri üremesi ve çözelti içindeki diğer kirlenmeler.

Sorunu gidermek için tıkanmanın olduğu yeri tespit edilmelidir. Bunun için, pompa çalışır halde iken pompa ile detektör arasındaki tüm vida bağlantıları dedektörden başlanarak pompaya doğru sırayla açılır ve burada basıncın belirgin şekilde nerede düştüğü belirlenir. Gerekirse tıkalı kılcal boruları değiştirilmelidir. Şayet sebep süzgeç veya filtreler ise, bunların yenilenmesi veya değiştirilmesi gerekir.

Önleyici tedbirler;

  • Çözeltinin 0,45 µm hassasiyetlikteki tek kullanımlık filtre ile filtrasyonu,

  • Kullanılan organik çözücülerdeki ve çözücü karışımlarındaki tampon tuzların çözünürlükerinin kontrolü,

  • Numunenin filtrasyonu,

  • Ana kolonun korunumu için ön veya koruyucu kolonların kullanımı

1.2. Çözünürlüğün Azalması veya Düşük Ayrım Etkisi

Kolonun güçlü bir şekilde alıkonan bir madde ile kirlenmesi sonucunda çözücü maddenin veya numunenin sebep olabileceği kirlilik unsurlarının numune ile kuvvetli ikincil bir etkileşime girmesi, kolon içindeki kuvvetli basınç darbeleri veya mekanik etkiler ile etkilenen dolgu yatağının dolgu maddesinde kanallar oluşturması ve kolon yatağında çökme meydana gelmesi sonucunda kromatogramlarda elde edilen çözünürlük giderek kötüleşmektedir. Pikler genişlemekte, asimetrik bir şekil almakta ve çift pikler belirmektedir.

Sorunu gidermek için kolon rejenere edilir. Şayet sebep dolgu maddesinin içinde kanal oluşumu ise bunun tamiri mümkün olmadığı için yeni bir kolon kullanılmalıdır.

Önleyici tedbirler;

  • İmkânlar dâhilinde her zaman bir ön kolon veya koruyucu kolon kullanılmalı, böylece kuvvetli şekilde alıkonan bileşiklerin analitik kolona ulaşmalarına mani olunacaktır. Şayet sorun yine ortaya çıkacak olursa, sadece ön veya koruyucu kolonun değiştirilmesi yeterlidir.

  • Kolon, basınç darbelerinden korunmalı ve sistem pompasının akış hızı, istenilen değere ulaşmak için kademeli olarak arttırılmalıdır.

  • Kolon mekanik etki ve darbelerden korunmalı, mümkünse kendi kutusu içerisinde muhafaza edilmelidir.

1.3. Basıncın Artması ve Ayrım Etkisinin Azalması

Optimum pH değerinin aşılması sonucunda silis jeli çözünebilmekte, bu durumda önce daha yüksek bir karşıt basınç üreten küçük parçacıklar, sonra da kolon girişinde bir boşluk oluşur, filtrelenmiş hareketli faz kullandığı halde, basınç birkaç saat içinde sürekli olarak artmaktadır. Böylece kromatogramda bant genişlemesi görülmektedir.

Bu sorunun giderilmesi için yüksek pH değerli çözücülerde doymuş kolonlar kullanılmalıdır. Doymuş kolonlar, pompa ile enjektör arasına kurulan kısa kolonlardır (genellikle ön kolonlar). Çözücü burada kolonun silis jeli ile zenginleşmekte ve ana kolonu korumaktadır. Doymuş kolonun içeriği, ayrıcı kolonda kullanılan dolgu maddesi ile aynı olmaldır. İlaveten ortaya çıkabilecek daha yüksek bir basınç artmasına mani olmak için, doymuş kolon içinde parçacık büyüklüğü daha büyük olan bir dolgu maddesinin kullanımı önerilmektedir.

1.4. Değişken Alıkonma Zamanları

Normal faz kromatografisinde laboratuardaki nem oranına bağlı olarak çözücü yüksek oranda su ihtiva edebilir ve bu da analitin kolondan daha önce ayrılmasına neden olmakta, bunun sonucunda alıkonma zamanları enjeksiyondan enjeksiyona değişkenlik göstermekte ve sürekli olarak azalmaktadır. Başlangıçtaki ayrım elde edilememektedir. Sorunu gidermek için hareketli faz moleküler süzgeç üzerinde kuru tutulmalı ve hareketli faza %1 oranında metanol gibi bir polar değiştirici katılmalıdır.

Ters faz kromatografisinde ise sorun genellikle HPLC pompasındadır. Alıkonma süresinin sürekli olarak azalması, durgun fazın emilim bölgelerindeki bir kaybı akla getirir. Silis jel tabanlı ters fazlarda buna sebep, genellikle hareketli fazın düşük pH (< 2) değerli olmasıdır. Burada silis jeli yüzeyindeki alkil zincirlerinin bağları tahrip olmaktadır. Sorunu gidermek için silis jel tabanlı durgun fazlarda mümkün olduğunca pH 2-8 aralığında çalışılmalıdır. pH < 2 değerlerinde çalışmanız gerekiyorsa, üretici tarafından açık şekilde bu pH aralığında çalışmanız için önerilen durgun fazlar tercih edilmelidir (örn. ChrometiSIL® C18 SH, ChrometiSIL® C18 ace-EPS).

1.5. Kolonda Ayrım İşleminin Gerçekleşmemesi

Muhtemelen yeni metot geliştiriminde kullanılan kolonun yüzey özelliklerini değiştiren bir çözücü kullanılması, kolonun önceden enjekte edilmiş numune parçalarıyla kirlenmiş olması ve kolonun uygun olmayan bir çözücü madde içerisinde depolanması sonucu kolonda karşılaştırılabilir bir ayrım işleminin gerçekleşememesidir.

Sorunu gidermek için seyir defteri tutulmalı, bu deftere kolonların kullanım süresi, kullanılan hareketli faz, kolonun depolandığı çözücü maddeler ve kullanıcılar kaydedilmelidir. Ayrıca metot geliştirimi için mutlaka yeni kolon kullanılmalıdır, durgun faz için yeni nesil (ultra saf) silis jeline dayalı fazlar tercih edilmelidir.

1.6. Yeni Kolon Kullanımından Kaynaklanan Sorunlar

Uzunca bir süre yapılan ayrım işleminin yeni bir kolon kullanılarak yapılmasında, maddelerin seçicilik ve alıkonmalarında olağan özelliklerin dışında belirgin şekilde değişiklikler öne çıkabilmektedir. Sorun mutlaka yeni kolondan kaynaklanmak zorunda değildir. Genelde yeni bir kolona geçildiğinde hareketli faz da değişmektedir.

Sorunu gidermek için, öncelikle HPLC cihazı ve hareketli fazı, “eski” ve eşdeğer özellikte bir kolon ile yeterlilik testine tabii tutularak kontrol edilmelidir. Kullanılan kolon yeterlilik testinin kriterlerini karşılayabiliyorsa, bunu yeni kolon ile değiştirip test yeniden başlatılmalıdır. Yeni kolon gerekli ayrım özelliklerini göstermiyorsa, kolon üreticisi ile iletişime geçilmelidir.

1.7. Kolonun Ayrım Performansının Değişiklik Göstermesi

Kolonun aşırı yüklenmesi sonucu kolonun ayrım etkinliğindeki değişiklik nedeniyle bir enjeksiyonda iyi bir ayrım elde ederken bir diğer enjeksiyonda geniş veya üst üste binmiş piklerin elde edilmesidir. Sorunu gidermek için sorunun aşırı yüklemeden kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak için numune yarı yarıya seyrekleştirilir ve bu şekilde enjeksiyon yapılır. Pikler daralma gösteriyorsa aşırı yükleme vardır. Bir kolonun yüklenebilirliğine ilişkin kabaca şu kurallar geçerlidir:

  • Kütlesel yüklenebilirlik sınırı: 100 µg/g durgun faz

  • Hacimsel yüklenebilirlik sınırı: 50 µl/g durgun faz

1.8. Pik Çatışması

Genellikle çözücü maddenin kuvvetinden ve kolon girişindeki ölü hacimden kaynaklanan sorunlar nedeniyle bileşiklerin alıkonma zamanı daha kısalmakta ve kromatogramdaki piklerin çatışmaktadır.

Bu sorunu gidermek için numune, imkanlar dahilinde çözücülüğü hareketli fazdan az veya ona yakın bir değere sahip çözücü bir maddede çözülmelidir. Sorun ölü hacim oluşması, dolgu maddesinin çökmesi veya yıkanması ise, onarmaya çalışılabilir. Bu az sayıda enjeksiyon için yardımcı olabilir. Fakat kısa bir süre içinde yeni bir kolon temin edilmelidir.

1.9. Kromatogramda Uçlanmalar

Gaz kabarcıkları içeren yani gazı iyi alınmamış çözücü maddeler ile içeriği kurumuş bir kolondan kaynaklanan gaz kabarcıkları kromatogramda uçlanmalara neden olmakta ve değerlendirmeyi güçleştirmektedir. Uçlanmalar sürekli olarak ve düzensiz bir şekilde ortaya çıkmaktadır. Kurumuş kolondaki gaz kabarcıklarının sebebiyet verdiği uçlanmalar oldukça inatçıdır. Tamamen kurumuş bir kolonda bu uçlanmalar, kromatogramda saatlerce görülebilir.

Sorunu gidermek için;

  • Çözücü maddeden kaynaklanan hava kabarcıklarını önlemek için çözücü madde ve bileşimleri kullanımdan önce havadan arındırılmalıdır. Bunun için ideal olanı sisteme gaz alıcı bir ünite bağlamak veya çözücü maddeden sürekli Helyum akışı sağlamaktır.

  • Kolonun kurumasını önlemek için, kolonun kullanılmadığı zamanlarda plastik kapaklar başlıklara vidalanarak kapatılmalıdır. Bir kolonun kuruması, kolon dolgu maddesi iyi doldurulmuşsa kolona bir zarar vermez, ancak kurumanın kromatogramda yol açtığı uçlanmalar kolonun bir süreliğine kullanımına mani olmaktadır.

  • Kurumuş kolonları ilk önce izopropanol ile akıtmak gereklidir. İzopropanol dolgu maddesi yüzeyini nemlendirerek oluşmuş gaz kabarcıklarını da emer.

1.10. Kolonun Sıkışık Doldurulması

Tampon çözeltiler 0,45µm membran filtreler ile süzülürken numuneler 0,20µm’lik membran filtrelerden süzülmelidir. Ayrıca kolon ters olarak bağlanıp düşük bir akış hızında yıkanabilir. Kolon sonu açılıp filtre yıkanabilir ve değiştirilebilir.

1.11. Örnek Adsorbsiyonu ve Solvent Kirliliği

Kolondaki safsızlıklar piklerde tailing olarak adlandırılan kuyruklanmaya neden olurlar. Temel olarak piklerde kuyruklanma nedenleri şu şekilde sıralanabilir:

  • Kolon girişinde kirlilik birikimi

  • Ölü kolon hacmi

  • Derişik örnek enjeksiyonu

  • Analit için uygun olmayan solvent seçimi

  • Silanol gruplarının ve kalıntı ağır metallerin varlığı

Silika jeller serbest silanol (OHˉ) gruplarına sahiptirler. Ortama aktif maddeleri (ODS, C8 vb.) dahil edilmesiyle silika jel apolar hale gelir. Modifiye edilmiş olan silika kolonlar bile yüzeyde serbest silanol grupları içerirler. Silanol grupları amin bileşiklerini absorbe ederler ve kuyruklanmaya neden olurlar. Bu durumda kolonun çözünürlüğü yüksek bir solvent ile yıkanması gerekir. Yıkama için kullanılabilecek en kuvvetli solvent tetrahidro furandır (THF). Bunun yanında asetonitril ile de yıkama yapılabilir. Ayrıca silanol gruplarını etkilerini ortadan kaldırmak için sonu kapalı kolonlar seçilmelidir. Bu kolonlarda trimetilsilil grupları ile muamele edilmelidir. Silika kolonlar normalde safsızlık olarak kalıntı ağır metalleri içerirler. Bu ağır metaller de şelat bileşenleri ile reaksiyona girerek kuyruklanmaya neden olurlar.

1.12. Mekanik Darbeler

Kolonda boşluk oluşumuna neden olmaktadır.  mekanik darbe sadece kolonun yere düşürülmesi olarak değerlendirilmemelidir. Analiz sırasında veya akış sırasında purge valfin açılması da mekanik şoka neden olabilmektedir. Boşluklarda piklerin bölünmesine neden olmaktadır. bunu ise tamiri oldukça zordur.

1.13. Dolgu Maddesinin Kimyasal Göçü

Analiz sırasında kullanılan mobil fazın veya numunenin hazırlandığı solventin özelliklerine (pH, basınç, sıcaklık ve solvent tipi) dikkat edilmelidir. Aksi taktirde kolon direkt olarak zarar görmektedir.

1.14. Dedektör Sorunları

Dedektör hücre hacmini büyük olması pik genişlemesine ve etkinliğin azalmasına neden olur. Pik genişlemesini sınırlamak ve maksimum etkinliği sağlamak için dedektör hücre hacmi minimize edilmelidir.

Noise ve drift, stabil olmayan baseline noise dedektör hücresinde örnek olmaksızın recorder sinyalinde meydan gelen dalgalanma olarak ifade edilebilir. Noise genellikle dedektör ve diğer elektroniklerin parçaları neden olmaktadır. Ayrıca mobil fazdaki değişimler (hava kabarcıkları, akış hızında veya basınçta değişim, sızıntı, safsızlıklar) ve sıcaklık dalgalanmaları da noise neden olmaktadır. Baseline drifti ise HPLC sisteminin ilk açılışında meydana gelmektedir. Eğer sistem ısındıktan sonra drift hale devam ediyor ise, muhtemelen mobil faz kompozisyonunda değişim, sızıntı, sıcaklık dalgalanmaları, kolon kanaması veya dedektör hücresinde hava kabarcığı vardır. Ayrıca yavaş yıkanma nedeniyle bir önceki örnekten kalan komponentler de drifte neden olabilmektedir.

Dedektörlerin her bileşene duyarlılığı aynı değildir. Diğer bir deyişle, her bileşiğin aynı miktarı farklı dedektörlerde aynı şiddette sinyal oluşturmaz. Bu nedenle kullanılan dedektöre ve koşullara göre ölçülen pik alanlarından veya pik yüksekliklerinden bileşik miktarına geçebilmek için, kalibrasyon eğrisinin hazırlanması ve hesaplamanın da ona göre düzenlenmesi gerekmektedir.

1.15. Kolon Dışı Bant Genişlemesi

                  Sıvı kromatografide, kolon dolgusunun dış kısmında bazen önemli bant genişlemesi meydana gelmektedir. Kolon dışı bant genişlemesi olarak adlandırılan bu olay, çözünmüş maddenin enjeksiyon sisteminde bulunan açık borularda, dedektör bölgesinde ve sistemin farklı parçalarını birbirine bağlayan boru bağlantılarında akışı sırasında meydana gelir. Buralarda, borunun merkezindeki ve çeperine yakın bölgedeki sıvı tabakalarının akış hızları arasında farktan dolayı genişleme meydana gelir. Sonuç olarak, çözünen maddenin oluşturduğu bandın merkezi, dış kısımdan daha hızlı hareket eder. Gaz kromatografide kolon dışı genişleme difüzyonla büyük ölçüde engellenir. Ancak sıvılardaki difüzyon büyük ölçüde yavaştır ve bu tip bant genişlemesi çoğu zaman önemsenecek duruma gelir.

            Küçük çaplı kolonlar kolonlar kullanıldığında kolon dışı genişleme oldukça ciddi boyutlara ulaşabilir. Burada kolon bağlantılarının yarıçapını 0,25 mm’nin altına düşürmek için her türlü gayret gösterilmelidir.

1.16. Sistemin Hava Yapması

            Sistemin hava yapmasını önlemenin en kestirme yolu, aygıtın bir parçası olarak gaz giderici satın almaktır.

1.17. Dikkat Edilmesi Gereken Diğer Durumlar

  • Eğer pompada hava varsa, basınç göstergesi aşağı yukarı hareket eder.

  • Sistemin ilk kurulduğunda (yani her şey en iyi durumdayken) aygıta ait tüm verilerin mutlaka kayıt altına alınması gerekir. Çünkü daha sonraki arızalarda bu kayıtların incelenmesi büyük kolaylık sağlayacaktır.

  • Kimi aygıtlarda pompa filtrelerinin temizlenmesi gerekir. Bunun için filtreler sökülür ve İPA (İsopropil alkol) içine atılır ve ultrason banyosuna bırakılır. Genelde 30-45 dakikalık ultrason işlemi temizlik için yeterli olur.

  • Taşıyıcı sıvı haznesinin çıkışındaki filtreye de dikkat edilmelidir. Gerçekte bu filtre diğerlerine göre daha çabuk tıkanır.

  1. UYGULAMALAR SIRASINDA KARŞILAŞILAN SORUNLAR VE ÇÖZÜM YOLLARI

2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Şekerler

            Gıda analizlerinde sık sık fruktoz, glukoz, sakaroz, laktoz ve maltoz analizine ihtiyaç duyulur.

            Düşük molekül ağırlıklı şekerler için örnek hazırlamanın en basit metodu doğrudan sulu ekstraksiyondur. Laboratuarlarda kullanılan bu usul, 65 ˚C’de hızlı ekstraksiyon ve daha sonra asetonitril ile seyreltme ve filtrasyondur. Bu pek çok gıda örneği için iyi bir sonuç verir, fakat iki muhtemel problem vardır. Birincisi, laktoz gibi çözünürlüğü düşük olan bir şekerin asetonitril ilave edildiğinde kısmen çökmesidir. İkincisi, şekerlerden başka sistemde interferense sebep olan pek çok polar komponentin sulu ekstraksiyonla ekstrakte geçebilmesidir. Bu maddeler kolonun ömrünü azaltabilir.

            Ekstraktaki potansiyel interferensleri azaltmak için ekstraksiyonda %80’lik etanol de kullanılabilir. Fakat ilgilenilen bütün şekerlerin yeterli derecede çözündüğünü garanti etmek gerekir. Ekstraksiyon oda sıcaklığında yapılabilir, fakat yüksek sıcaklıklarda geri soğutucu altında yapılması yaygındır. Bu durumda sakarozun inversiyonundan sakınılmalıdır.

            Alternatif bir yaklaşım ilk ekstraksiyondan sonra interferens yapan maddelerin uzaklaştırılmasıdır. Bunu başarmanın birçok yolu vardır. Eğer ekstrat alkolik bir çözelti ile hazırlanmışsa, ekstratta lipidler bulunacaktır. Bu kloroform gibi alkolle karışmayan bir sıvı ilavesiyle ortadan kaldırılabilir. Carrez solüsyonu veya kurşun asetat gibi ağartma eczalarının ilavesi, polisakkaritler, proteinler gibi büyük çözünür moleküllerin ortadan kaldırılması için faydalı olabilir. Bu, şeker kompozisyonunu değiştiren enzim aktivitesi örnekte mevcutsa, özellikle önemlidir. Bu durumda herhangi bir ısıtma uygulamadan önce eczalar ilave edilmiş olmalıdır. Alternatif olarak sodyum azid veya gümüş nitrat gibi bir madde enzimi inaktif yapmak için ilave edilebilir.

            Aminoasitler ve organik asitler gibi küçük molekül ağırlığı kirleticilerin uzaklaştırılması için karışık yatay iyon değiştirme reçineleri faydalıdır. Bu ekseriya şarap, meyve, meyve suyu analizlerinde uygulanır, fakat şekerlerin reçine tarafından alıkonulmadığından emin olmak gerekir. Sep-Pak kartuşlar gibi küçük zıt-faz kartuşlar gibi küçük zıt-faz kolonlar, arzu edilmeyen kontaminantları uzaklaştırmada kullanılabilir. Ekstrat katı partiküllerden arındırılmış olmalıdır. Bu nedenle gerekliyse filtre edilir.

            Düşük molekül ağırlıklı şekerler için amino bağlı silika kolonların kullanıldığı analizlerde 15-25 cm kolon uzunluğu ve %70-80 asetonitril içeren sulu bir mobil faz kullanmak gerekir. Dedeksiyon RI dedektörle yapılır. Enjeksiyon miktarı genellikle 10-100 μl’dir. Glukoz-galaktoz arasındaki zayıf rezolüsyon RI dedektörün kullanım sınırını tayin eder. Dereceli elüsyona izin veren bir dedektör ve dereceli elüsyon sistemi kullanılarak iki şeker arasındaki separasyon ıslah edilebilir.

            Silika kolonda ayrılmaları zor olan glukoz-galaktoz birbirinden katyon değiştirme kolonunda kolaylıkla ayrılabilir.

2.2. Oligosakkaritler  

            Buğday veya mısır nişastasının asidik veya enzimatik parçalanması sonucu meydana gelen glukoz polimerlerini içeren şurubun analizi HPLC ile yapılabilir.

            Oligosakkaritleri analiz etmek için uygulanan iyon-değiştirme metodları genellikle karbonhidrat materyalinin hepsini elute eder, fakat 10 glukoz ünitesinden daha büyük olanları ayıramaz. Aksine, amino bağlı silika kolonlar dereceli elüsyona izin veren bir dedektör kullanılması halinde en az 18 glukoz ünitesine kadar ayrılabilir. Pulsed amperometrik dedektör kullanılan anyon-değiştirme metodu 22 glukoz inütesine kadar ayırım göstermektedir, fakat dedektör duyarlılığı için molar düzeyde konsantrasyon gereklidir.

            Oligosakkarit analizleri için kullanılan metodlar düşük molekül ağırlıklı şekerlerinkine benzer. Aynı amino kolonlar kullanılır, fakat mobil fazdaki su yüzdesi %40-60 arasındadır. Analiz süreleri daha uzundur. Kullanılan katyon değiştirme reçineleri benzerdir, fakat farklı zıt iyona sahiptirler. Bu amaçla kalsiyum ve gümüş yaygın bir şekilde kullanılırlar. Separasyon gücü kolonlar seri bağlanılarak arttırılabilir.

            Diğer bir uygulama alanı, amiloz ve amilopektin gibi nişasta fraksiyonlarına ilişkindir. Bu sistemler sert jel filtrasyon kolonları kullanılırlar. Çözünürlük problemleri yüzünden mobil faz olarak dimetilsülfoksid kullanılır. İyi bir rezolüsyon elde etmek için 0,3 ml/dak gibi düşük akış hızları gereklidir. Komponentlerin hepsi bir kolon hacminde elute olurlar.

KAYNAKÇA

  1. Gündüz, T., (1997) Kantitatif Analiz Laboratuar Kitabı, Bilge Yayıncılık, Ankara.

  2. Hışıl, Y., (1994) Enstrumental Gıda Analizleri, Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Bornova İzmir.

  3. Yetim, H., ve Çam, M., (2009) Enstrumental Gıda Analizleri, Erciyes Üniversitesi Yayınları, Kayseri.

  4. Yıldırm, Z., (2000) Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi, Ankara İl Kontrol Laboratuar Müdürlüğü.

  5. Anonim (2010), http://www.tarimsal.com/laboratuvarkurmak.html, erşim tarihi 15.04.2010

HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi ( Arş.Gör. Nahit GENÇER )

HPLC

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi
HPLC Nedir?
HPLC’nin Kısımları:
Hareketli Faz Rezervuarı
Pompa Sistemi
Numune enjeksiyon Sistemi
Kolon
Dedektör
HPLC Çeşitleri
HPLC Uygulamaları

HPLC

Yüksek performans sıvı kromotografisi (High Performance Liquid Chromatography : HPLC) ; en yaygın olarak kullanılan analitik tekniklerden bir tanesidir.
Kromatografik prosesler, durgun ve hareketli fazlar arasında kütle transferini kapsayan ayırma teknikleri olarak tanımlanırlar.
HPLC; bir karışımdaki bileşenlerin ayrılmasında sıvı hareketli fazı kullanır. Bu bileşenler ilk olarak çözgende çözünürleştirilirler ve daha sonra yüksek basınç altında kromatografi kolonundan geçmeye zorlanırlar.
Başlangıçta basınç; modern sıvı kromatografisinin temel kriteri olarak düşünülmekteydi ve bu nedenle “Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi” olarak adlandırılmaktaydı.
Ancak bu günümüzde geçersiz kabul edilmektedir. Çünkü yüksek performans yalnız basıncın değil bir çok faktörün birleşmesiyle ortaya çıkmaktadır.

Bu faktörler ;
-Dar bir dağılım aralığında çok küçük partiküllerin kullanılması,
– Uniform gözenek boyutu ve dağılımı,
– Yüksek basınçta kolon paketleme,
– Doğru, düşük hacimli örnek enjektörleri,
– Duyarlı dedöktörler,
– İyi pompalama sistemi kullanımı,

olarak sınıflandırılır. Bu nedenlerden dolayı Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi terimi kullanılmaktadır.

HPLC’nın diğer klasik tekniklerle kıyaslandığında;

Küçük boyutlu paslanmaz çelik kolonların kullanılması,
Partikül boyutları çok küçük (3,5-10 mm) matrikslerin kullanılması,
Yüksek iç basınç ve kontrollü akış hızı sağlanabilmesi,
Örnek gereksinimlerinin az olması,
Sürekli akış dedektörleri ile küçük miktarların tayinine olanak sağlaması,
Otomasyona müsait olması,
Hızlı analiz imkanı ve yüksek ayırma gücüne sahip olması
nedeniyle çok yönlü uygulamalara daha açık olduğu görülmektedir.
Bu gelişmelerin; adsorbsiyon, dağılım, iyon değişim, moleküler elek ve affinite kromatografi tekniklerine de yansımasıyla hızlı ve daha iyi ayrım gücü sağlanmıştır.

HPLC’nın KISIMLARI

HPLC aletleri genelde;
hareketli faz rezervuarı,
pompa,
enjektör,
kolon,
dedektör ve kaydedici (veya veri sistemi) içerirler.

Ayırma kolonda gerçekleşir.Durgun faz mm boyutlu poröz partiküllerden oluşur, bu nedenle hareketli fazın kolondan geçişi için yüksek basınç pompalarına ihtiyaç vardır.
Kromatografik proses kolona örneğin enjeksiyonu ile başlar.
Bileşenlerin ayrılması analit ve hareketli fazın kolona pompalanması ile devam eder.
Ayrılarak elue olan her bir kompenentin pikleri kaydedilir.
Her bir komponent için alınan dedektör cevabı bir kaydedici veya bilgisayar ekranında kromotogram olarak görüntülenir.

1- Hareketli Faz Kapları ve Çözücü Muamele Sistemleri

Modern bir HPLC cihazında bir veya daha çok cam veya paslanmaz çelik kaplar bulunur. Bunların her biri 500 mL’den daha fazla çözücü alacak kapasiteye sahiptir.
Sistemde kullanılan hareketli fazın seçimi uygulanan ayırma tipine bağlıdır. Bu nedenle sulu tamponlardan hidrokarbonlara kadar farklı polaritede çözücüler kullanılır. HPLC sistemlerinde kullanılacak tüm çözgenler çok saf olmalıdır. İz miktardaki safsızlıklar kolonu etkileyerek dedeksiyon sisteminde girişime neden olabilirler.
Tüm solventlerin gazının alınması (degassing) zorunludur, aksi taktirde çözgende hava kabarcıklarının bulunması pompa ve kolonda problemlere neden olmaktadır. (Örneğin; kolonda kabarcık oluşturarak pik genişlemesine yol açar.)
Gazın alınması farklı şekillerde gerçekleştirilebilir; solventlerin ısıtılması, karıştırarak vakuma maruz bırakma, ultra sonifikasyon veya çözgen rezervuarına helyum gazı verilmesi.
Sonuç olarak hareketli fazda bulunması gereken özellikler; saflık, dedektöre uyumluluk, örneğin çözünürlüğü, düşük viskozite, kimyasal inertlik ve uygun fiyat olarak sıralayabiliriz.
Hareketli faz , örnek ve sabit faz arasındaki etkileşimlerin ayarlanabilmesi için değiştirilmektedir.
Hareketli faz tipleri; izokratik, gradiyent ve politipik olmak üzere üç formda uygulanabilir.
İzokratik elüsyonda bileşenler sabit bileşimli tek bir çözücü ile elüe edilirler. Tüm bileşenler kolonda aynı anda, farklı hızlarda göç ederler.
Gradiyenet elüsyon; polarlıkları birbirinden farklı iki (veya bazen daha fazla) çözücü sistemlerinin kullanıldığı tekniktir. Çözücü bileşimi sürekli veya basamaklı olarak değiştirilir.
Politipik hareketli faz, karışık tip kromatografilerde tercih edilebilir. Aynı kolonu kullanarak birçok kromatografik teknik için uygulanabilir.
Pompa sistemleri
HPLC pompası, sıvı kromatografi sisteminin en önemli kısımlarından bir tanesidir. Sistemde; elüent’in; enjektör, kolon ve dedektör boyunca sürekli sabit akışını sağlayan kısımdır.

HPLC analizlerinde kullanılan bir çok tip pompa mevcuttur. Bunlar; Emme Basma Piston Pompalar, Şırınga Tipi Pompalar ve Sabit Basınç Pompalarıdır.
Sıvı kromatografide kullanılan pompaların şu özellikleri bulunmalıdır:

– 5000 psi (1b/in2) ye kadar basınçlar oluşturabilmeli,
– Pulssuz sıvı çıkışı bulunmalı
– Akış hızı 0,1’den 10mL/dakika’ya kadar ayarlanabilmeli,
– Sıvı akış hızlarının tekrarlanabilirliği %0,5 veya daha iyi olmalı,
– Çok sayıda çözücünün korozyon etkisine karşı dayanıklı olmalıdır.

Numune Enjeksiyon Sistemi

Örnekler; HPLC’ye enjeksiyon ünitesinden enjekte edilir. Enjeksiyon ünitesi basit olarak bir enjeksiyon valfi ve örnek haznesinden oluşur.
Örnek Enjeksiyon öncesi hareketli fazda çözülerek bir şırınga ile valften enjekte edilir.
Kolon

HPLC’de kullanılan ayırma kolonları genellikle paslanmaz çelik olup yüksek basınçlara dayanıklıdır. Sıklıkla kullanılan kolonlar 4.5-5.0 mm iç çaplı ve 10-30 cm uzunluğundaki kolonlardır. Ancak araştırmanın ihtiyacına göre çok farklı boyutlarda kolonları ticari firmalardan temin etmek mümkündür.
Durgun Faz;

Kolon Dolgu Materyali:

HPLC durgun fazı kolon içindeki katı destek maddesidir. Örnek solüsyonunun, kolona enjeksiyonu ile non-kovalent etkileşim olmaksızın durgun fazda bileşenlerin göçü söz konusudur.
Durgun faz ve örneğin hareketli faz ile kimyasal etkileşimleri, göç derecesi ve örnek bileşenlerin ayrılmasını belirler.
Uygulanacak kromatografi türünün prensibine göre kolon dolgu maddeleri farklıdır. (Kromatografi tipleri; sıvı-katı adsorpsiyon, normal faz, zıt- faz, iyon değişimi vb.)
Kolon dolgu materyalleri genellikle silika ve alümina esaslıdır; gözenekli (poröz), küresel spherical), düzensiz (irregular), pelliküler (pellicular) ve mikro tiplerinde olmaktadır.
Dolgu maddesinin seçiminde tanecik biçimi, büyüklüğü, tanecik büyüklüğünün dağılımı, gözenek hacmi ve yüzey alanı gibi özellikler rol oynar. Yapılacak çalışmanın cinsine göre seçim yapılmalıdır.

Kolonların doldurulması

HPLC kolonları; değişik dolgu materyali yapılarında ve boyutlarda ticari firmalardan temin edilebilirler. Ancak birçok araştırıcı ucuz olması nedeniyle kendi kolonlarını doldurmayı tercih eder. Kolon doldurulmasında kullanılacak metot, dolgu materyalinin tabiatına ve partikül büyüklüğüne bağlıdır.

Dedektör

Dedektörler, kolondan elüe olan örnek bileşeninden alınan cevap doğrultusunda sinyallerin kromatogram üzerinde pik olarak ifade edilmesini sağlayan alettir. Dedektörler kolon sonrasına monte edilir.
HPLC için ideal bir dedektör; geniş konsantrasyon aralığında; yüksek duyarlılığa, düşük gürültü seviyesine, bilinen seçiciliğe sahip olmalı ve kromatografik rezolüsyona kötü etki yapmaksızın kolon akıntısındaki bileşiklere duyarlı olmalıdır. Böyle bir dedektör sıcaklık ve basınçtaki değişmelere de duyarsız olmalıdır.
Kullanılacak dedektör sistemi, analizi yapılacak numunenin cinsine uygun olmalıdır.
Sıvı kromatografisinde en çok kullanılan dedektörler, ultraviyole veya görünür ışığın absorpsiyonuna dayanırlar.

HPLC ÇEŞİTLERİ

Sıvı kolon kromatografisinin sınıflandırılması durgun faz ve ayırma prosesinin tabiatı üzerine yapılıyorsa bu durumda dört sınıftan bahsedilebilir.

1) İyon değişim kromatografisi
2) Moleküler elek kromatografisi (Jel Filtrasyon)
3) Affinite kromatografisi
4) Adsorbsiyon kromatografisi
Normal Faz Kromatografisi Ters Faz Kromatografisiâ
RP-HPLC (Ters Faz Kromatografisi) :

Çok sayıda organik bileşiği ayırabilme yeteneğinden dolayı tercihen sıklıkla kullanılan HPLC türüdür. Durgun faz apolardır, hareketli faz ise polar bir sıvıdır. Apolar materyallerin kolonda tutulması söz konusudur.

HPLC UYGULAMALARI

Preparatif HPLC, bileşiklerin izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılır.
Kimyasal ayırmalar, bir kolon ve hareketli fazda bileşiklerin farklı güç hızlarına göre ayrılması temeline dayanır.
Saflaştırma; hedef bileşiğin diğer bileşikler veya kontaminantlardan ayrılması ve ekstraksiyonudur. Her bir bileşik belirli kromatografik koşullar altında karakteristik bir pike sahiptir. Ayrılması istenen bileşenin ihtiyaçlarına göre araştırıcının koşulları optimize etmesi gerekmektedir.
HPLC ile bileşiklerin identifikasyonu yapılır.
Miktar tayini; konsantrasyonu bilinmeyen bir örneğin solüsyonda tayin edilmesi; genelde örneğin standart çözeltisinin bilinen farklı miktarlarının kolona verilmesi ve elde edilen değerlerin korelasyonunun yapılması ile mümkün olabilmektedir. Genelde korelasyon pik alanları veya pik yüksekliklerinin kullanılması ile yapılır.
Yüksek Performanslı Dağılım Kromatografisinin Tipik Uygulamaları

High Performance Liquid Chromatography ( Dr.Hüseyin BOZKURT )

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is one mode of chromatography, the most widely used analytical technique. Chromatographic processes can be defined as separation techniques involving mass-transfer between stationary and mobile phases. Present day liquid chromatography that generally utilizes very small packing particles and a relatively high pressure is referred to as high performance liquid chromatography (HPLC).

HPLC utilizes a liquid mobile phase to separate the components of a mixture. These components are first dissolved in a solvent, and then forced to flow through a chromatographic column under high pressure. In the column, the mixture is resolved into its components. The amount of resolution is important, and is dependent upon the extent of interaction between the solute componentsand the stationary phase. The stationary phase is defined as the immobile packing material in the column. The interaction of the solute with mobile and stationary phases can be manipulated through different choices of both solvents and stationary phases. As a result, HPLC acquires a high degree of versatility not found in other chromatographic systems and has the ability to easily separate a wide variety of chemical mixtures.

HPLC ( Erciyes Üniversitesi )

HPLC’nin teorisi ve kullanım sahası

Kullanılan modüller ve işlevleri
Ayırma tekniklerinin sınıflandırılması
KROMATOGRAFİ NEDİR?
Thin-Layer Chromatography (TLC)
Column Chromatography
Gas Chromatography (GC)
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Supercritical Fluid Chromatography (SFC)
Capillary Electrophoresis (CE)
Hareketli Faz (Mobile Phase) Sıvı veya Gas
Sabit Faz (Stationary Phase) solid partikül veya ince bir sıvı film ile kaplanmış solid partikül
HPLC Sistemi Akış Diyagramı
ISOCRATIC SYSTEM
GRADIENT SYSTEM
HPLC SİSTEM MODÜLLERİ
HPLC ’de AYIRMA TEKNİKLERİ
NORMAL FAZ
HİDROJEN BAĞI
TERS FAZ KOLONLARI
SABİT FAZIN ETKİSİ
İYON ÇİFTİ REAKTİFLERİ
İYON DEĞİŞTİRİCİ KOLONLAR
İYON KROMATOGRAFİDE ETKİLEŞİM
Size Exclusion Chromatography – SEC-
SEC’de ETKİLEŞİM
CHIRAL SEPARATION
Enjeksiyon tekniği
Detektör tipleri ve çalışma mekanizmaları
Sonuçların doğrulanması ve güvenirliğin sağlanması
DEDEKTÖRLER
Ultraviolet / Visible detector (UV/VIS)
Photodiode Array detector (PDA)
Fluorescence detector (RF)
Conductivity detector (CDD)
Refractive Index detector (RID)
Electrochemical detector (ECD)
Mass detector (MS)
Evaporative Light Scattering detector (EL)
UV DEDEKTÖR
PHOTODIODE ARRAY DETECTOR
FLORESANS DEDEKTÖR
Sıklıkla ortaya çıkan sorunlar, muhtemel nedenleri ve çözümleri
BAND GENİŞLEMESİ
FRONTİNG / TAİLİNG
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK
PİKLERİN ÇATALLANMASI
PİK ŞEKİLLERİNDE BOZUKLUK
BASELİNE PROBLEMLERİ
BASINÇ YÜKSELMESİ
BASINÇ DÜŞMESİ
KOLON’un FİZİKSEL DEFORMASYONU