HPLC’de Karşılaşılan Sorunlar, Nedenleri ve Çözüm Yolları

  1. HPLC’DE KARŞILAŞILAN SORUNLAR, NEDENLERİ VE ÇÖZÜM YOLLARI

HPLC sisteminde karşılaşılan sorunlar genel olarak şu şekilde sıralanabilir;

  1. Basıncın artması

  2. Çözünürlüğün azalması veya düşük ayrım etkisi

  3. Basıncın artması ve ayrım etkisinin azalması

  4. Değişken alıkonma zamanları

  5. Kolonda ayrım işleminin gerçekleşmemesi

  6. Yeni kolon kullanımından kaynaklanan sorunlar

  7. Kolonun ayrım performansının değişiklik göstermesi

  8. Pik çatışması

  9. Kromatogramda uçlanmalar

  10. Kolonun sıkışık doldurulması

  11. Örnek adsorbsiyonu ve solvent kirliliği

  12. Mekanik darbeler

  13. Dolgu maddesinin kimyasal göçü

  14. Dedektör sorunları

  15. Kolon dışı bant genişlemesi

  16. Sistemin hava yapması

  17. Dikkat edilmesi gereken diğer durumlar

1.1. Basıncın Artması

HPLC sisteminde giriş kılcal borularının, kolonun ve dedektör hücresinin tıkanması nedeniyle cihazda karşıt basınç sürekli olarak artmakta ve başlangıç değerini %10 aşmaktadır.

Tıkanıklıklar şu sebeplerden kaynaklanabilir:

  • Mekanik kirlenmeler, pompa contalarında aşınma, enjektör valfındaki rotor pistonunun aşınması,

  • Dökülen tampon tuzlar ve numuneler,

  • Bakteri üremesi ve çözelti içindeki diğer kirlenmeler.

Sorunu gidermek için tıkanmanın olduğu yeri tespit edilmelidir. Bunun için, pompa çalışır halde iken pompa ile detektör arasındaki tüm vida bağlantıları dedektörden başlanarak pompaya doğru sırayla açılır ve burada basıncın belirgin şekilde nerede düştüğü belirlenir. Gerekirse tıkalı kılcal boruları değiştirilmelidir. Şayet sebep süzgeç veya filtreler ise, bunların yenilenmesi veya değiştirilmesi gerekir.

Önleyici tedbirler;

  • Çözeltinin 0,45 µm hassasiyetlikteki tek kullanımlık filtre ile filtrasyonu,

  • Kullanılan organik çözücülerdeki ve çözücü karışımlarındaki tampon tuzların çözünürlükerinin kontrolü,

  • Numunenin filtrasyonu,

  • Ana kolonun korunumu için ön veya koruyucu kolonların kullanımı

1.2. Çözünürlüğün Azalması veya Düşük Ayrım Etkisi

Kolonun güçlü bir şekilde alıkonan bir madde ile kirlenmesi sonucunda çözücü maddenin veya numunenin sebep olabileceği kirlilik unsurlarının numune ile kuvvetli ikincil bir etkileşime girmesi, kolon içindeki kuvvetli basınç darbeleri veya mekanik etkiler ile etkilenen dolgu yatağının dolgu maddesinde kanallar oluşturması ve kolon yatağında çökme meydana gelmesi sonucunda kromatogramlarda elde edilen çözünürlük giderek kötüleşmektedir. Pikler genişlemekte, asimetrik bir şekil almakta ve çift pikler belirmektedir.

Sorunu gidermek için kolon rejenere edilir. Şayet sebep dolgu maddesinin içinde kanal oluşumu ise bunun tamiri mümkün olmadığı için yeni bir kolon kullanılmalıdır.

Önleyici tedbirler;

  • İmkânlar dâhilinde her zaman bir ön kolon veya koruyucu kolon kullanılmalı, böylece kuvvetli şekilde alıkonan bileşiklerin analitik kolona ulaşmalarına mani olunacaktır. Şayet sorun yine ortaya çıkacak olursa, sadece ön veya koruyucu kolonun değiştirilmesi yeterlidir.

  • Kolon, basınç darbelerinden korunmalı ve sistem pompasının akış hızı, istenilen değere ulaşmak için kademeli olarak arttırılmalıdır.

  • Kolon mekanik etki ve darbelerden korunmalı, mümkünse kendi kutusu içerisinde muhafaza edilmelidir.

1.3. Basıncın Artması ve Ayrım Etkisinin Azalması

Optimum pH değerinin aşılması sonucunda silis jeli çözünebilmekte, bu durumda önce daha yüksek bir karşıt basınç üreten küçük parçacıklar, sonra da kolon girişinde bir boşluk oluşur, filtrelenmiş hareketli faz kullandığı halde, basınç birkaç saat içinde sürekli olarak artmaktadır. Böylece kromatogramda bant genişlemesi görülmektedir.

Bu sorunun giderilmesi için yüksek pH değerli çözücülerde doymuş kolonlar kullanılmalıdır. Doymuş kolonlar, pompa ile enjektör arasına kurulan kısa kolonlardır (genellikle ön kolonlar). Çözücü burada kolonun silis jeli ile zenginleşmekte ve ana kolonu korumaktadır. Doymuş kolonun içeriği, ayrıcı kolonda kullanılan dolgu maddesi ile aynı olmaldır. İlaveten ortaya çıkabilecek daha yüksek bir basınç artmasına mani olmak için, doymuş kolon içinde parçacık büyüklüğü daha büyük olan bir dolgu maddesinin kullanımı önerilmektedir.

1.4. Değişken Alıkonma Zamanları

Normal faz kromatografisinde laboratuardaki nem oranına bağlı olarak çözücü yüksek oranda su ihtiva edebilir ve bu da analitin kolondan daha önce ayrılmasına neden olmakta, bunun sonucunda alıkonma zamanları enjeksiyondan enjeksiyona değişkenlik göstermekte ve sürekli olarak azalmaktadır. Başlangıçtaki ayrım elde edilememektedir. Sorunu gidermek için hareketli faz moleküler süzgeç üzerinde kuru tutulmalı ve hareketli faza %1 oranında metanol gibi bir polar değiştirici katılmalıdır.

Ters faz kromatografisinde ise sorun genellikle HPLC pompasındadır. Alıkonma süresinin sürekli olarak azalması, durgun fazın emilim bölgelerindeki bir kaybı akla getirir. Silis jel tabanlı ters fazlarda buna sebep, genellikle hareketli fazın düşük pH (< 2) değerli olmasıdır. Burada silis jeli yüzeyindeki alkil zincirlerinin bağları tahrip olmaktadır. Sorunu gidermek için silis jel tabanlı durgun fazlarda mümkün olduğunca pH 2-8 aralığında çalışılmalıdır. pH < 2 değerlerinde çalışmanız gerekiyorsa, üretici tarafından açık şekilde bu pH aralığında çalışmanız için önerilen durgun fazlar tercih edilmelidir (örn. ChrometiSIL® C18 SH, ChrometiSIL® C18 ace-EPS).

1.5. Kolonda Ayrım İşleminin Gerçekleşmemesi

Muhtemelen yeni metot geliştiriminde kullanılan kolonun yüzey özelliklerini değiştiren bir çözücü kullanılması, kolonun önceden enjekte edilmiş numune parçalarıyla kirlenmiş olması ve kolonun uygun olmayan bir çözücü madde içerisinde depolanması sonucu kolonda karşılaştırılabilir bir ayrım işleminin gerçekleşememesidir.

Sorunu gidermek için seyir defteri tutulmalı, bu deftere kolonların kullanım süresi, kullanılan hareketli faz, kolonun depolandığı çözücü maddeler ve kullanıcılar kaydedilmelidir. Ayrıca metot geliştirimi için mutlaka yeni kolon kullanılmalıdır, durgun faz için yeni nesil (ultra saf) silis jeline dayalı fazlar tercih edilmelidir.

1.6. Yeni Kolon Kullanımından Kaynaklanan Sorunlar

Uzunca bir süre yapılan ayrım işleminin yeni bir kolon kullanılarak yapılmasında, maddelerin seçicilik ve alıkonmalarında olağan özelliklerin dışında belirgin şekilde değişiklikler öne çıkabilmektedir. Sorun mutlaka yeni kolondan kaynaklanmak zorunda değildir. Genelde yeni bir kolona geçildiğinde hareketli faz da değişmektedir.

Sorunu gidermek için, öncelikle HPLC cihazı ve hareketli fazı, “eski” ve eşdeğer özellikte bir kolon ile yeterlilik testine tabii tutularak kontrol edilmelidir. Kullanılan kolon yeterlilik testinin kriterlerini karşılayabiliyorsa, bunu yeni kolon ile değiştirip test yeniden başlatılmalıdır. Yeni kolon gerekli ayrım özelliklerini göstermiyorsa, kolon üreticisi ile iletişime geçilmelidir.

1.7. Kolonun Ayrım Performansının Değişiklik Göstermesi

Kolonun aşırı yüklenmesi sonucu kolonun ayrım etkinliğindeki değişiklik nedeniyle bir enjeksiyonda iyi bir ayrım elde ederken bir diğer enjeksiyonda geniş veya üst üste binmiş piklerin elde edilmesidir. Sorunu gidermek için sorunun aşırı yüklemeden kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak için numune yarı yarıya seyrekleştirilir ve bu şekilde enjeksiyon yapılır. Pikler daralma gösteriyorsa aşırı yükleme vardır. Bir kolonun yüklenebilirliğine ilişkin kabaca şu kurallar geçerlidir:

  • Kütlesel yüklenebilirlik sınırı: 100 µg/g durgun faz

  • Hacimsel yüklenebilirlik sınırı: 50 µl/g durgun faz

1.8. Pik Çatışması

Genellikle çözücü maddenin kuvvetinden ve kolon girişindeki ölü hacimden kaynaklanan sorunlar nedeniyle bileşiklerin alıkonma zamanı daha kısalmakta ve kromatogramdaki piklerin çatışmaktadır.

Bu sorunu gidermek için numune, imkanlar dahilinde çözücülüğü hareketli fazdan az veya ona yakın bir değere sahip çözücü bir maddede çözülmelidir. Sorun ölü hacim oluşması, dolgu maddesinin çökmesi veya yıkanması ise, onarmaya çalışılabilir. Bu az sayıda enjeksiyon için yardımcı olabilir. Fakat kısa bir süre içinde yeni bir kolon temin edilmelidir.

1.9. Kromatogramda Uçlanmalar

Gaz kabarcıkları içeren yani gazı iyi alınmamış çözücü maddeler ile içeriği kurumuş bir kolondan kaynaklanan gaz kabarcıkları kromatogramda uçlanmalara neden olmakta ve değerlendirmeyi güçleştirmektedir. Uçlanmalar sürekli olarak ve düzensiz bir şekilde ortaya çıkmaktadır. Kurumuş kolondaki gaz kabarcıklarının sebebiyet verdiği uçlanmalar oldukça inatçıdır. Tamamen kurumuş bir kolonda bu uçlanmalar, kromatogramda saatlerce görülebilir.

Sorunu gidermek için;

  • Çözücü maddeden kaynaklanan hava kabarcıklarını önlemek için çözücü madde ve bileşimleri kullanımdan önce havadan arındırılmalıdır. Bunun için ideal olanı sisteme gaz alıcı bir ünite bağlamak veya çözücü maddeden sürekli Helyum akışı sağlamaktır.

  • Kolonun kurumasını önlemek için, kolonun kullanılmadığı zamanlarda plastik kapaklar başlıklara vidalanarak kapatılmalıdır. Bir kolonun kuruması, kolon dolgu maddesi iyi doldurulmuşsa kolona bir zarar vermez, ancak kurumanın kromatogramda yol açtığı uçlanmalar kolonun bir süreliğine kullanımına mani olmaktadır.

  • Kurumuş kolonları ilk önce izopropanol ile akıtmak gereklidir. İzopropanol dolgu maddesi yüzeyini nemlendirerek oluşmuş gaz kabarcıklarını da emer.

1.10. Kolonun Sıkışık Doldurulması

Tampon çözeltiler 0,45µm membran filtreler ile süzülürken numuneler 0,20µm’lik membran filtrelerden süzülmelidir. Ayrıca kolon ters olarak bağlanıp düşük bir akış hızında yıkanabilir. Kolon sonu açılıp filtre yıkanabilir ve değiştirilebilir.

1.11. Örnek Adsorbsiyonu ve Solvent Kirliliği

Kolondaki safsızlıklar piklerde tailing olarak adlandırılan kuyruklanmaya neden olurlar. Temel olarak piklerde kuyruklanma nedenleri şu şekilde sıralanabilir:

  • Kolon girişinde kirlilik birikimi

  • Ölü kolon hacmi

  • Derişik örnek enjeksiyonu

  • Analit için uygun olmayan solvent seçimi

  • Silanol gruplarının ve kalıntı ağır metallerin varlığı

Silika jeller serbest silanol (OHˉ) gruplarına sahiptirler. Ortama aktif maddeleri (ODS, C8 vb.) dahil edilmesiyle silika jel apolar hale gelir. Modifiye edilmiş olan silika kolonlar bile yüzeyde serbest silanol grupları içerirler. Silanol grupları amin bileşiklerini absorbe ederler ve kuyruklanmaya neden olurlar. Bu durumda kolonun çözünürlüğü yüksek bir solvent ile yıkanması gerekir. Yıkama için kullanılabilecek en kuvvetli solvent tetrahidro furandır (THF). Bunun yanında asetonitril ile de yıkama yapılabilir. Ayrıca silanol gruplarını etkilerini ortadan kaldırmak için sonu kapalı kolonlar seçilmelidir. Bu kolonlarda trimetilsilil grupları ile muamele edilmelidir. Silika kolonlar normalde safsızlık olarak kalıntı ağır metalleri içerirler. Bu ağır metaller de şelat bileşenleri ile reaksiyona girerek kuyruklanmaya neden olurlar.

1.12. Mekanik Darbeler

Kolonda boşluk oluşumuna neden olmaktadır.  mekanik darbe sadece kolonun yere düşürülmesi olarak değerlendirilmemelidir. Analiz sırasında veya akış sırasında purge valfin açılması da mekanik şoka neden olabilmektedir. Boşluklarda piklerin bölünmesine neden olmaktadır. bunu ise tamiri oldukça zordur.

1.13. Dolgu Maddesinin Kimyasal Göçü

Analiz sırasında kullanılan mobil fazın veya numunenin hazırlandığı solventin özelliklerine (pH, basınç, sıcaklık ve solvent tipi) dikkat edilmelidir. Aksi taktirde kolon direkt olarak zarar görmektedir.

1.14. Dedektör Sorunları

Dedektör hücre hacmini büyük olması pik genişlemesine ve etkinliğin azalmasına neden olur. Pik genişlemesini sınırlamak ve maksimum etkinliği sağlamak için dedektör hücre hacmi minimize edilmelidir.

Noise ve drift, stabil olmayan baseline noise dedektör hücresinde örnek olmaksızın recorder sinyalinde meydan gelen dalgalanma olarak ifade edilebilir. Noise genellikle dedektör ve diğer elektroniklerin parçaları neden olmaktadır. Ayrıca mobil fazdaki değişimler (hava kabarcıkları, akış hızında veya basınçta değişim, sızıntı, safsızlıklar) ve sıcaklık dalgalanmaları da noise neden olmaktadır. Baseline drifti ise HPLC sisteminin ilk açılışında meydana gelmektedir. Eğer sistem ısındıktan sonra drift hale devam ediyor ise, muhtemelen mobil faz kompozisyonunda değişim, sızıntı, sıcaklık dalgalanmaları, kolon kanaması veya dedektör hücresinde hava kabarcığı vardır. Ayrıca yavaş yıkanma nedeniyle bir önceki örnekten kalan komponentler de drifte neden olabilmektedir.

Dedektörlerin her bileşene duyarlılığı aynı değildir. Diğer bir deyişle, her bileşiğin aynı miktarı farklı dedektörlerde aynı şiddette sinyal oluşturmaz. Bu nedenle kullanılan dedektöre ve koşullara göre ölçülen pik alanlarından veya pik yüksekliklerinden bileşik miktarına geçebilmek için, kalibrasyon eğrisinin hazırlanması ve hesaplamanın da ona göre düzenlenmesi gerekmektedir.

1.15. Kolon Dışı Bant Genişlemesi

                  Sıvı kromatografide, kolon dolgusunun dış kısmında bazen önemli bant genişlemesi meydana gelmektedir. Kolon dışı bant genişlemesi olarak adlandırılan bu olay, çözünmüş maddenin enjeksiyon sisteminde bulunan açık borularda, dedektör bölgesinde ve sistemin farklı parçalarını birbirine bağlayan boru bağlantılarında akışı sırasında meydana gelir. Buralarda, borunun merkezindeki ve çeperine yakın bölgedeki sıvı tabakalarının akış hızları arasında farktan dolayı genişleme meydana gelir. Sonuç olarak, çözünen maddenin oluşturduğu bandın merkezi, dış kısımdan daha hızlı hareket eder. Gaz kromatografide kolon dışı genişleme difüzyonla büyük ölçüde engellenir. Ancak sıvılardaki difüzyon büyük ölçüde yavaştır ve bu tip bant genişlemesi çoğu zaman önemsenecek duruma gelir.

            Küçük çaplı kolonlar kolonlar kullanıldığında kolon dışı genişleme oldukça ciddi boyutlara ulaşabilir. Burada kolon bağlantılarının yarıçapını 0,25 mm’nin altına düşürmek için her türlü gayret gösterilmelidir.

1.16. Sistemin Hava Yapması

            Sistemin hava yapmasını önlemenin en kestirme yolu, aygıtın bir parçası olarak gaz giderici satın almaktır.

1.17. Dikkat Edilmesi Gereken Diğer Durumlar

  • Eğer pompada hava varsa, basınç göstergesi aşağı yukarı hareket eder.

  • Sistemin ilk kurulduğunda (yani her şey en iyi durumdayken) aygıta ait tüm verilerin mutlaka kayıt altına alınması gerekir. Çünkü daha sonraki arızalarda bu kayıtların incelenmesi büyük kolaylık sağlayacaktır.

  • Kimi aygıtlarda pompa filtrelerinin temizlenmesi gerekir. Bunun için filtreler sökülür ve İPA (İsopropil alkol) içine atılır ve ultrason banyosuna bırakılır. Genelde 30-45 dakikalık ultrason işlemi temizlik için yeterli olur.

  • Taşıyıcı sıvı haznesinin çıkışındaki filtreye de dikkat edilmelidir. Gerçekte bu filtre diğerlerine göre daha çabuk tıkanır.

  1. UYGULAMALAR SIRASINDA KARŞILAŞILAN SORUNLAR VE ÇÖZÜM YOLLARI

2.1. Düşük Molekül Ağırlıklı Şekerler

            Gıda analizlerinde sık sık fruktoz, glukoz, sakaroz, laktoz ve maltoz analizine ihtiyaç duyulur.

            Düşük molekül ağırlıklı şekerler için örnek hazırlamanın en basit metodu doğrudan sulu ekstraksiyondur. Laboratuarlarda kullanılan bu usul, 65 ˚C’de hızlı ekstraksiyon ve daha sonra asetonitril ile seyreltme ve filtrasyondur. Bu pek çok gıda örneği için iyi bir sonuç verir, fakat iki muhtemel problem vardır. Birincisi, laktoz gibi çözünürlüğü düşük olan bir şekerin asetonitril ilave edildiğinde kısmen çökmesidir. İkincisi, şekerlerden başka sistemde interferense sebep olan pek çok polar komponentin sulu ekstraksiyonla ekstrakte geçebilmesidir. Bu maddeler kolonun ömrünü azaltabilir.

            Ekstraktaki potansiyel interferensleri azaltmak için ekstraksiyonda %80’lik etanol de kullanılabilir. Fakat ilgilenilen bütün şekerlerin yeterli derecede çözündüğünü garanti etmek gerekir. Ekstraksiyon oda sıcaklığında yapılabilir, fakat yüksek sıcaklıklarda geri soğutucu altında yapılması yaygındır. Bu durumda sakarozun inversiyonundan sakınılmalıdır.

            Alternatif bir yaklaşım ilk ekstraksiyondan sonra interferens yapan maddelerin uzaklaştırılmasıdır. Bunu başarmanın birçok yolu vardır. Eğer ekstrat alkolik bir çözelti ile hazırlanmışsa, ekstratta lipidler bulunacaktır. Bu kloroform gibi alkolle karışmayan bir sıvı ilavesiyle ortadan kaldırılabilir. Carrez solüsyonu veya kurşun asetat gibi ağartma eczalarının ilavesi, polisakkaritler, proteinler gibi büyük çözünür moleküllerin ortadan kaldırılması için faydalı olabilir. Bu, şeker kompozisyonunu değiştiren enzim aktivitesi örnekte mevcutsa, özellikle önemlidir. Bu durumda herhangi bir ısıtma uygulamadan önce eczalar ilave edilmiş olmalıdır. Alternatif olarak sodyum azid veya gümüş nitrat gibi bir madde enzimi inaktif yapmak için ilave edilebilir.

            Aminoasitler ve organik asitler gibi küçük molekül ağırlığı kirleticilerin uzaklaştırılması için karışık yatay iyon değiştirme reçineleri faydalıdır. Bu ekseriya şarap, meyve, meyve suyu analizlerinde uygulanır, fakat şekerlerin reçine tarafından alıkonulmadığından emin olmak gerekir. Sep-Pak kartuşlar gibi küçük zıt-faz kartuşlar gibi küçük zıt-faz kolonlar, arzu edilmeyen kontaminantları uzaklaştırmada kullanılabilir. Ekstrat katı partiküllerden arındırılmış olmalıdır. Bu nedenle gerekliyse filtre edilir.

            Düşük molekül ağırlıklı şekerler için amino bağlı silika kolonların kullanıldığı analizlerde 15-25 cm kolon uzunluğu ve %70-80 asetonitril içeren sulu bir mobil faz kullanmak gerekir. Dedeksiyon RI dedektörle yapılır. Enjeksiyon miktarı genellikle 10-100 μl’dir. Glukoz-galaktoz arasındaki zayıf rezolüsyon RI dedektörün kullanım sınırını tayin eder. Dereceli elüsyona izin veren bir dedektör ve dereceli elüsyon sistemi kullanılarak iki şeker arasındaki separasyon ıslah edilebilir.

            Silika kolonda ayrılmaları zor olan glukoz-galaktoz birbirinden katyon değiştirme kolonunda kolaylıkla ayrılabilir.

2.2. Oligosakkaritler  

            Buğday veya mısır nişastasının asidik veya enzimatik parçalanması sonucu meydana gelen glukoz polimerlerini içeren şurubun analizi HPLC ile yapılabilir.

            Oligosakkaritleri analiz etmek için uygulanan iyon-değiştirme metodları genellikle karbonhidrat materyalinin hepsini elute eder, fakat 10 glukoz ünitesinden daha büyük olanları ayıramaz. Aksine, amino bağlı silika kolonlar dereceli elüsyona izin veren bir dedektör kullanılması halinde en az 18 glukoz ünitesine kadar ayrılabilir. Pulsed amperometrik dedektör kullanılan anyon-değiştirme metodu 22 glukoz inütesine kadar ayırım göstermektedir, fakat dedektör duyarlılığı için molar düzeyde konsantrasyon gereklidir.

            Oligosakkarit analizleri için kullanılan metodlar düşük molekül ağırlıklı şekerlerinkine benzer. Aynı amino kolonlar kullanılır, fakat mobil fazdaki su yüzdesi %40-60 arasındadır. Analiz süreleri daha uzundur. Kullanılan katyon değiştirme reçineleri benzerdir, fakat farklı zıt iyona sahiptirler. Bu amaçla kalsiyum ve gümüş yaygın bir şekilde kullanılırlar. Separasyon gücü kolonlar seri bağlanılarak arttırılabilir.

            Diğer bir uygulama alanı, amiloz ve amilopektin gibi nişasta fraksiyonlarına ilişkindir. Bu sistemler sert jel filtrasyon kolonları kullanılırlar. Çözünürlük problemleri yüzünden mobil faz olarak dimetilsülfoksid kullanılır. İyi bir rezolüsyon elde etmek için 0,3 ml/dak gibi düşük akış hızları gereklidir. Komponentlerin hepsi bir kolon hacminde elute olurlar.

KAYNAKÇA

  1. Gündüz, T., (1997) Kantitatif Analiz Laboratuar Kitabı, Bilge Yayıncılık, Ankara.

  2. Hışıl, Y., (1994) Enstrumental Gıda Analizleri, Ege Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümü, Bornova İzmir.

  3. Yetim, H., ve Çam, M., (2009) Enstrumental Gıda Analizleri, Erciyes Üniversitesi Yayınları, Kayseri.

  4. Yıldırm, Z., (2000) Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi, Ankara İl Kontrol Laboratuar Müdürlüğü.

  5. Anonim (2010), http://www.tarimsal.com/laboratuvarkurmak.html, erşim tarihi 15.04.2010

Facebook Yorumları

Bir Cevap Yazın