SIVI KROMATOGRAFİSİ

Ref. e_makaleleri, Enstrümantal Analiz Solvent verme sistemi Kolon doldurma sistemi rezervuarlar akış ayırıcı örnek injeksiyon noktası solvent 1 solvent 2 vakum basınç pompası göstergesi n gaz giderici 1 gaz giderici 2 o l k i n o t i k l o a l gaz gidericiler n n o ö a k yüksek basınç karıştırma pompası Solvent kabı injeksiyonu Dedektör fraksiyon atık toplayıcı www.tags-search.com/hplc-instrumentation/tag.html Şekil-1: Tipik bir sıvı kromatografisi cihazında sıvı akışını gösteren diyagram

1. KOLON KROMATOGRAFİ Klasik sıvı kromatografisi yönteminde çap ı 10-50 mm olan ve 50-500 cm uzunlu- ğunda katı sabit faz malzemesi içeren cam tüpler kullan ılır. Uygun bir akış h ızı alınabilmesi için katı malzemenin tanecik büyüklüğünün 150-200 mikrometreden fazla olması gerekir. Dolgu maddesinin yukar ısındaki sıvının yüksekliği hareketli fazı kolon boyunca yürütebilecek seviyede olmal ıdır. En iyi akış h ızı dakikada bir mililitrenin onda bir kaçı kadard ır ve tabii ayırma işleminde harcanan zaman da fazla olur. Klasik uygulamanın çabuklaştırılması için s ıvı ak ış h ızının vakumla çekilerek veya pompa ile ittirilerek hızlandırılması olumlu sonuçlar vermez. Sıvı kromatografisinin uygulanmaya başlandığı ilk y ıllarda kolon veriminin, dolgu maddesinin tanecik boyutları küçültülerek önemli derecede art ırılabileceği düşü- nülmüştür. 1960 yıllarında çapı 10 mikrometre gibi çok küçük taneciklerin üretildiği ve kullanıldığı yeni bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu teknolojide, klasik sıvı kromatografisinde kullanılan basit sistemlerin tersine çok karmaşık cihazlara ge- reksinim vardır. “Yüksek-performanslı s ıvı kromatografisi, HPLC (highperformance liquid chromatography)” denilen bu tip cihazlar klasik kromatografilerde yapılamayan uygulamalarda çok başarılıdır. Yüksek – Performanslı Sıvı Kromatografisi Şekil-2’de, deneyle elde edilen bir sıvı kromatografisi verilerinin grafikleri verilmiş- tir; şekilde tepsi yüksekliğinin, akış h ızı ve dolgu maddesinin tanecik çap ına göre değişimleri görülmektedir. Eğrilerin hiç birinde, bir minimum yoktur; sıv ı kromatografisinde bu tip minimumlarla sadece çok düşük akış h ızlarında karşıla- şılır. Yine aynı konuda görülen denklem(8), verim ile hareketli faz aras ındaki iliş- kiyi yeteri derecede tanımlayamaz; burada, Giddings tarafından çıkarılan daha kompleks bir denklem kullanılır (J.C Gidings, Anal. Chem., 35, 1338, 1963). Şekil-1’de ayırma veriminin, küçük tanecik çaplarında çok arttığı aç ık bir şekilde görülmekledir. Bu tip maddelerle hazırlanan kolonlarda uygun akış h ızları, yüksek basınçlı pompa ile sağlanabilmiştir. Bu da HPLC cihazındaki sistemin klasik sıvı kromatografisinde kullanılan yükleme (kendi ağırlığı ile) kolonuna göre çok daha ayrıntılı ve karmaşık olduğunu gösterir. Şekil-2’de böyle bir cihazın bölümlerinin gösterildiği bir blok diyagram verilmiştir.

44.7 mm k’ = 1.2 m m 4.0 , H i, 34.9 mm ğ i 3.0 l k e s k ü y 2.0 i s p e 22.6 mm T 1.0 13.2 mm 8.8 mm 0.0 0 10 20 30 40 Doğrusal hız, cm/s Şekil-2: Dolgu maddesi tanecik büyüklüğünün ve akış hızının tepsi yüksekliğine (H) etkisi. Kolon boyutları 30 cm x 2.4 mm dir; madde N,N-dietil-p-aminobenzen, hareketli faz heksan, metilen klorür ve izopropil alkoldür; dolgu maddesi corosil II ince slikajel a. Solvent Verme Sistemi Çözgen (Solvent) Rezervuarı ve Gaz Giderme Sistemi Modern bir HPLC cihazında, her biri 1-2 lt kapasiteli bir veya daha fazla cam veya paslanmaz çelik rezervuarlar bulunur. Rezervuarlarda çözünmüş gazlar ı, çoğun- lukla oksijen ve azotu, giderecek düzenekler vardır. Bu gibi gazlar kolonda ve dedektör sistemlerinde kabarcıklar oluşturarak çalışmayı bozarlar; band genişle- mesine ve dedektörün algılama bozukluğuna neden olurlar. Gaz giderici düzenek- lerde bir vakum pompa sistemi, bir distilasyon sistemi veya Çözgeni ısıtan ve karıştıran bir sistem bulunur. Tek bir çözgenin kullanıldığı ay ırmaya “tek kaynaklı (isokratik) s ıyırma” denir. Polariteleri birbirinden önemli derecede farklı olan iki (bazan daha çok) çözgenin kullanıldığı ve “dereceli s ıyırma (gradient)” adı verilen yöntemde ay ırma verimi oldukça yüksektir. Sıyırma işlemi başlatıldıktan sonra iki çözgenin oranları prog- ramlı bir şekilde değiştirilir; değiştirme bazan sürekli, bazan da kademeli olarak

yapılır. Modern HPLC cihazlarında, iki veya daha fazla rezervuardan bir karıştır- ma odacığına sürekli olarak değişen hızlarda çözgen verilir; Çözgenlerin hacimleri arasındaki oran zamanla doğrusal veya üstel fonksiyon olarak değiştirilebilir. Şekil-3’de dereceli sıyırma işlemi ile yapılan iyi bir ayırma görülmektedir. 3b’ deki kromatogramda sıyırmada hacimce 50/50 metanol/su çözeltisi kullanılmıştır. 3a’daki kromatogramda ise ayni çözgen çifti sıyırmanın başlangıcında 40/50 ora- nında olacak ve sonra metanol oranı dakikada % 8 h ızla artacak şekilde bir uygu- lama yapılmıştır. Dereceli sıyırma yöntemiyle yapılan ayırmalarda, ilk çıkan pik- lerde herhangi bir bozulma olmaksızın ayırma süresi kısaltılabilir. 1. benzen 2. monoklorobenzen 3. o-diklorobenzen 4. 1,2,3-triklorobenzen 5. 1,3,5-triklorobenzen 6. 1,2,4-triklorobenzen 7. 1,2,3,4-tetraklorobenzen 8. 1,2,4,5-tetraklorobenzen 9. pentaklorobenzen 10. heksaklorobenzen (a) (b) Al ıkonma zamanı, dakika Alıkonma zamanı, dakika Kolon: 1 m x 2.1 mm (iç çap), hassas-delikli paslanmaz çelik; dolgu maddesi: %1 permafaz ODS; örnek: 5 mL, izopropil alkolde çözünmüş klorlu benzenler; detektör: UV fotometre (254 nm); sıcaklık 60 0C, basınç 1200 psi Şekil-3: Kademeli sıyırma ile ayırma veriminin artırılması; (a) dereceli sıyırma (b) tek kaynaklı sıyırma

Pompalar 2 HPLC cihazlarının çoğundaki pompaların çıkış bas ıncı 1000 psi (libre/inc ) den büyüktür, dakikada 3 ml hızla akış sağlayan 4000-6000 psi lik pompalar tercih edilir. Akış h ızı ± % 2 lik bir toleransla sabit olmal ıdır. Bu amaçla kullanılabilen iki mekanik pompa tipi vardır; bunlar: · Vidal ı (screw-driven) şırınga tipi pompalar · Pistonlu pompalar Birinci tip pompalarda kolaylıkla kontrol edilebilen, darbesiz bir akım alınır; ancak kapasitede düşme ve çözgen oranlarının değiştirilmesinde sorunlarla karşılaşılır. Pistonlu pompaların kullanım alanları daha geniştir, kademeli olarak azaltılan miktarlarda darbeli bir akım verir. Pistonlu pompaların avantajı istenildiği kadar çözgen basabilmesidir; ayrıca iç hacminin küçük olması dereceli s ıyırma işlemi için ideal bir durumdur (Şekil-4). HPLC cihazlarında pnömatik pompalar da kullanılabilir; en basitinde hareketli faz, sıkıştırılmış hava ile bas ınçlandırılan bir kabın içindeki portatif bir rezervuarda bulunur. Basittir, ucuzdur ve darbesiz akım verirler; kapasiteleri ve çıkış bas ınçları sınırlıdır, çözgenin viskozitesine göre akış h ızı değişir. Ancak dereceli sıyırma işlemi için uygun değildir. kolon puls motor damper conta kontrol vanaları piston solvent http://faculty.atu.edu/abhuiyan/Course/Chem%204414/Chapter%2028.ppt#14 Şekil-4: Bir pistonlu pompanın şematik görünümü

Pompalarla yüksek basınçlara çıkılmasının herhangi bir tehlike yaratmayacağını belirtmek gerekir, sıvılar fazla sıkıştırılamadıklarından sistemin bir parçasında meydana gelebilecek kopma veya açılma sadece çözgen sızıntısına yol açar. b. Kolon Doldurma Sistemi ve Örnek İnjeksiyonu Ön Kolonlar Bazı HPLC cihazlar ında çok bilinen ön kolonlar vardır. Ön kolonlardaki dolgu maddesi analitik kolondaki dolgu maddesi ile kimyasal yapı bak ımından aynidir, fakat tanecik boyutları daha büyüktür. Böylece ön kolon boyunca olan bas ınç düşmesi, sistemin geri kalan kısmındakine kıyasla ihmal edilebilir bir düzeydedir. Ön kolonun amacı, çözgendeki safsızlıkları tutarak analitik kolonun kirlenmesini önlemektir. Ayrıca ön kolon hareketli fazı s ıvı ile doyurarak sabit faz ı oluşturur; böyle bir durumda analitik kolondaki dolgu maddesinden sabit fazın sıyrılması işlemine gerek olmaz. (Şekil-5c) Örnek İnjeksiyon Sistemleri HPLC’de en çok döner örnek valf sistemi kullanılır. (Şekil-5a). Bazan kızak valflerde de kullanılmaktadır. (Şekil-5b). Kızak, Kel-F’den üretilmiştir ve iki tetrafluoroetilen parçası aras ındaki düzlemde hareket eder konumdadır. Örnek valfe bir şırınga ile çekilir, sonra kızak soldan sağa doğru hareket ederek örneğin solvent akımı içine girmesini sağlar. Örnek injeksiyonu bir şırıngayla da yapılabilir. İnjektör İgnesi silikon, neopren veya teflondan yapılmış bir conta (septum)’ya bat ırılarak sisteme verilir; injektör çekildiğinde conta kendi kendini kapatır. Kolonlar HPLC kolonları kal ın kenarlı cam tüpten veya hassas-delikli paslanmaz çelik bo- rudan yapılır. İnert yüzeylerin gerektiği özel kimyasal maddeler ve biyolojik uygu- lamalar da PEEK (bir mühendislik plastiğidir) ve cam tüp kolonlar kullanılır (600 psi altındaki basınçlarda). Kolon uzunlukları çoğunlukla 15-150 cm, iç çapı 2-3 mm kadard ır. 1 m veya daha uzun kolonlar, kısa kolonları ucuca bağlıyarak hazırlanabilir. Kolonlar sarılmış halde kullanılır; bu durumda kolon veriminde biraz düşme gözlenir.

şırınga şırınga örnek yüklenmesi örnek injeksiyonu / / C s 8 i s % y l A a örnek örnek n B A % / 4 w E o h % 6 s 2 1 h- A # i T b % P / A P w . t A ) u. % k d o 6 ( atık atık e. E 2 u % 2 g 0 c B 2 o. A % m % R e 6 E m 8 T / % P / kolona kolona : 9 A pE t H (a) solvent solvent t h % C giriş yükleme hareketli faza şırıngasına besleme ön kolon poröz titanyum beden kayıcı k ısım ceket ana örnek odacığı kolon poröz kolon titanyum örnek girişi (b) (c) çıkış Şekil-5: HPLC, (a) döner örnek valfi, (b) kızak örnek valfi, (c) ön ve ana kolonun şematik görünümleri

HPLC kolonlarında en fazla kullanılan dolgu maddesi mikroporöz silikadır. Alumina ve Celite (diyatome toprağı) de çok kullanılan maddelerdir. Dolgu mad- delerin tanecik büyüklüklerinin 1.5-10 mikrometre aralığında olması istenir. N = 2000 tepsi tanecik büyüklüğü = 4 mm m 10 mm u s m n , o i p ğ i s l e k r e s r k ö ü 5 mm t N = 7500 tepsi k y e tanecik i d s 3 mm e büyüklüğü = 1.7 mm p D e T Akış h ızı, mL/dakika http://memo.cgu.edu.tw/bih-show/Analysis/ Zaman, dakika %E9%86%AB%E6%AA%A2%E4%BA%8C/CHAPTER%2022(ok).PPT#16 Şekil-6: Dolgu maddesi tanecik büyüklüğünün kolon tepsi yüksekliği ve dedektör responsuyla ilişkisi İkinci bir tip dolgu maddesi zarlı (pellicular) taneciklerdir; bunlar 40 mikrometre kadar çaptaki cam taneciklerinin, 1-3 mm kalınlıkta silika jel, alumina veya bir iyon değiştirici reçine gibi poröz bir madde ile kaplanarak hazırlanır. Böyle bir ince tabaka fazlar arasındaki dengenin hızla kurulmasını sağlar; böylece kolon verimi yükselir. Zarlı dolgu maddeli kolonlara s ınırlı miktarlarda örnek verilebilir; bu mik- tar pöröz maddenin ancak onda biri kadar olabilir.

d. Dedektörler HPLC’de, gaz kromatografide olduğu gibi çok hassas dedektör sistemlerine ge- reksinim olmaz. Bu nedenle örneğe bağlı olarak çeşitli dedektörler kullanılabilir. Tablo-1’de çok kullanılan dedektörler ve özellikleri verilmiştir. Tablo-1: Bazı Sıvı Kromatografisi Dedektörlerinin Özellikileri Hassasiyet (g/ml), Ak ış h ızına has- Sıcaklığa hassa- Dedektör maksimum sasiyet siyet -10 UV absorbsiyon 5 x 10 yok düşük -6 IR absorbsiyon 10 yok düşük -10 Fluorometre 10 yok düşük -7 -4 0 Refraktif indeks 5 x 10 yok ± 10 C -8 0 Kondüktometre 10 var ± 1 C -8 Hareketli tel 10 var yok -10 Kütle spektrometresi 10 yok yok Polarograf i 10-10 var ± 1 0C Radyoaktivite yok yok Ultraviole ve Görünür Iışık Dedektörler En çok kullanılan dedektörler ultraviyole veya görünür ışın absorbsiyonuna daya- nan dedektörlerdir. Fotometreler ve spektrofotometreler ticari cihazlardır. Foto- metrelerde bir civa kaynaklan alınan 254 ve 280 nm bandları kullan ılır; bu dalga boylarında pek çok organik fonksiyonel grup absorbsiyon yapar. Spektrofotometrik dedektörler fotometrelerden daha elverişlidir, çünkü bunlarda örnekteki maddelerin absorbsiyon yapacağı dalga boylar ını seçme olanağı vard ır. Fotometrik dedektörlerde cihazın dalga boyu aralığında, örnekteki maddelerin ışığı absorblamas ı, fakat çözgenin herhangi bir absorbsiyona neden olmaması gerekir. Şekil-7’de ultraviyole fotometrik bir dedektörün şematik diyagramı veril- miştir.

örnek kolondan giriş çıkış UV filtre kuvartz pencereler UV fototüpler UV dedektör kaynağı kaynağı kuvartz kuvartz pencere pencere giriş ç ıkış solvent atık Şekil-7: HPLC ultraviyole dedektörler Refraktif İndeks Dedektörler Refraktif indeks bir bulk özelliğidir, dolayısıyla refraktif indeks dedektörünün algı- laması hareketli fazdaki tüm komponentlerin toplam refraktif indeksine dayan ır. Refraktif indeks dedektörü en az hassas sıvı kromatografisi dedektörüdür; çevre sıcaklığı, basınç, akış h ızı değiştiğinde dedektörün algılaması da değişir. Çeşitli dezavantajlarına rağmen, refraktif indeks dedektörleri, noniyonikler, UV bölgede absorbsiyon yapamayan maddeler ve flüoresans olmayan bileşikler için çok uy- gun dedektörlerdir. Refraktif indeks dedektörleri çeşitlidir; diferansiyel refraktif indeks, Fresnel metodu, Christiansen etki, interferometre, termal lens, dielektrik sabiti dedektörler gibi. Şekil-8’da bir diferansiyel refraktif indeks dedektörünün şematik diyagramı veril- miştir. Burada çözgen ve analit çözeltileri bir cam levha ile birbirinden ayrılmıştır. Cam levha, iki çözeltinin refraktif indeksleri birbirinden farklı olduğunda gelen ışının sapmasını sağlayacak bir aç ı ile yerleştirilmiştir. Bir ışık demeti optik mas- keden geçerek hücre bölmesine gelir. Mercekler demeti yönlendirerek örnek ve referans hücrelerden geçmesini ve düz aynaya gelmesini sağlarlar. Ayna demeti yansıtarak tekrar örnek ve referans hücrelerine gönderir. Mercekten geçen demet bir fotosel üzerine odaklanır. Demetin yerini şiddeti değil, açısal sapması belirler; sapma, iki hücredeki maddeler arasındaki refraktif indeks farkının bir sonucudur.

Fotoelektrik hücrede demetin odak konumu (yeri) değiştiğinde çıkış da değişir ve fark sinyal elektronik olarak modifiye edilerek örnek hücresindeki madde konsant- rasyonuyla orantılı bir sinyal şekline dönüştürülür. örnek ayna ışık kaynağı maske sensör mercek sıfır kaydedici ayarı amplifier ve referans güç kaynağı http://www.chromatography-online.org/HPLC-Detectors/ Refractive-Index-Based/Angle-of-Deviation-Method/rs21.html Şekil-8: Refraktif indeks dedektörü (sapma açısına göre) Transport Dedektör Tansport dedektör metal zincir, tel veya disk gibi bir taşıyıcıdır. Sürekli olarak kolon akımından geçer, örneğin bulunduğu hareketli fazdan örneği ekstrakt eder ve yüzeyinde ince bir film tabakası halinde biriktirir; film üzerinde kalan hareketli faz buharlaştırılarak uzaklaştırılır. Bu işlemden sonra taşıyıcı, üzerinde biriken maddenin saptanması için uygun bir alg ılama sistemiyle taranır. Bu amaçla, ör- neğin, piroliz ürünlerinin saptanması istendiğinde alev iyonizasyon dedektörü (FID) kullanılır; bunun için taşıyıcı ısıtılır, örnekteki piroliz ürünleri açığa çıkar ve ürünler çoğunlukla karbon içerdiğinden FID ile algılanır. Hareketli fazda uçucu olmayan maddeler bulunması halinde doğru sonuç vermez, ayrıca kullanılan solventin uçucu ve çok saf olması gerekir. Şekil-9’da, transport dedektörlere bir örnek olarak hareketli tel (moving wire) dedektörün şematik diyagramı verilmiştir. Bu tip bir dedektörde, sürekli hareket eden bir tel halka ile sıyırıcının bir kısmı bir alev iyonizasyon dedektörüne taşınır. Tel önce sıyırıcıdan geçer, onu bir fırına taşır ve burada sıyırıcının çözgeni buhar- laşır. Buradan azot atmosferi altında tutulan piroliz fırınına gelen örnek piroliz

olur; piroliz ürünleri azot gazıyla taşınarak alev iyonizasyon dedektörü (FID) için- deki merkez tüpe taşınır ve bileşenler iyonizasyon dedektörü tarafından algılanır. FID, hareketli fazdaki solventten etkilenmeyen bir dedektördür. oksijen dedektör fırını buharlaştırıcı fırını FID hidrojen kolondan N N N 2 2 2 piroliz fırını N 2 temizleyici fırını http://www.chromatography-online.org/HPLC- Detectors/Transport/Moving-Wire/rs64.html Şekil-9Pye Unicam hareketli tel dedektörü Elektrokimyasal Dedektör Elektrokimyasal dedektör uygun elektrotların bulunduğu bir hücrede analitin oksit- lenme/indirgenme reaksiyonları sonucunda oluşan akımın ölçülmesi esasına göre çalışır. Doğan akımın seviyesi doğrudan analit konsantrasyonuyla orantılı oldu- ğundan bu tip dedektörler kantitatif tayine olanak verir. Elektrokimyasal dedektölerin uygulama alanı fazla geniş değildir; fakat hassasiye- tinin yüksek olması nedeniye özellikle doğal ürünler ve yiyecek maddeleri incel- melerinde kullanılır. Oksijen, metal kirlilikleri ve halojenler ölçmelerde önemli hata- lara neden olurlar. Elektrokimyasal dedektörlerde üç elektrot bulunur; oksitlenme veya indirgrnme reaksiyonunun olduğu iş elektrodu, yard ımcı elektrot ve referans elektrot. Refe- rans elektrot hareketli fazın taban iletkenliğinde olabilecek değişiklikleri dengeler. Eektrotlar çeşitli geometrik şekillerde yerleştirilebilir; ince tabaka hücrelerde en çok kullanılan yerleşimler şekil-10(b) ve (c)’degörüldüğü gibidir.

iş referans elektrot elektrodu referans ve (b) yardımcı elektrotlar çözelti içidedir iş elektrodu yardımcı elektrot referans (c) elektrot çözelti yardımcı içidedir elektrot (a) iş elektrodu http://www.sec.psu.ac.th/web-board/ ?pid=view_replies&thread_id=722&forum_id=7 Şekil-10: (a) Bir elektrokimyasal dedektör, (b), (c) farklı elektrod konfigürasyonları Kütle spektroskopisi de hassas bir özel dedektör olarak kullanılmaktadır. Ticari bir cihazda sıyırıcıyı iyon kaynağına taşıyan bir paslanmaz çelik veya poliimid kayış vardır. Kaynağa ulaşmadan önce kayış bir infrared buharlaştırıcının altından ge- çerek sıyırıcıdaki solventin büyük bir kısmı buharlaşır, sonra iki farklı vakum oda- sından geçen örnek kütle spektrofotometresine girer. Burada örnek, iyon odacığı içine püskürtülerek buharlaştırılır. Tayin sınırları 0.2-1 ng gibi çok düşük değerler arasındadır. Yüksek performans sıvı kromatografisinde hareketli faz s ıvıdır. Sabit faz katı, sıv ı tabakası, iyon değiştirici reçine, mikroporöz tanecikler, modifiye reçineler gibi değişik maddeler olabilir. Sabit faza göre ayırma mekanizmaları da farkl ılıklar gösterir; şöyle ki: 1. Adsorbsiyon (S ıvı-Katı) Kromatografisi 2. Dağılma (Partition) Kromatografisi 3. İyon-Değiştirme Kromatografi 4. Jel geçirgenlik veya Jel süzme (Moleküler-Exclusion veya Size-Exclusion) Kromatografi)

1. Adsorbsiyon (Sıvı-Katı) Kromatografisi Kromatografideki ilk uygulamaların tamamı adsorbsiyon esas ına dayanıyordu, burada sabit faz çok ince bir katı maddenin yüzeyidir. Böyle bir dolgu maddesinde madde ve sıyırıcı solvent kat ı yüzeyi üzerinde yar ış halindedirler ve adsorbsiyon kuvvetlerin etkisi altındadırlar. Nötral organik bileşiklerin ayrılmasında en çok kul- lanılan yöntem HPLC yöntemi ile sıvı-katı kromatografisidir. Bir maddenin bir çözgen ve adsorblayıcı bir kat ı madde aras ındaki en ideal dağılımı, “Kromatografiye Giriş, Şekil-1″deki A eğrisi adsorbsiyon izotermi ile tanımlanır. Bu eğri düşük konsantrasyonlarda bir doğruya yakındır; bu durum sıyırma işleminin doğrusal olduğunu ve pik bozulmasının da en düşük düzeyde bulunduğunu göste- rir. yüzeyde adsorblanan madde www.chem.ufl.edu/~cao/ chm4130/lecture18.ppt Sabit ve Hareketli Fazlar Sıvı-katı kromatografisinde en çok kullan ılan adsorblayıcı silika jel ve Aluminad ır. Dolgu maddelerinin tanecik büyüklükleri çok çeşitli olabilir; HPLC’de kullanılan tipik silika jel dolgu maddesinin tanecik büyüklüğü 10 mm dir ve malzemenin % 80′ i 8-12 mm aralığına girer. Sıvı-katı kromatografisinde başarı, hareketli fazın seçimine bağlıdır; solvent de- ğiştirilerek maddelerin kapasite faktörü (k’), ideal değerler olan 1-10 aralığına girecek şekilde değiştirilebilir. Bir solventin k’ değerine etkisi, onun sıyırma gücü (e0) ne bağlıdır, bu ise bazı referans solventlere karşı relatif olarak ölçülebilir. Ör- neğin X maddesi için (K ) X 1 0 0 log ¾¾¾ = A (e – e ) X 2 1 (K ) X 2

yazılabilir. Burada (K ) ve (K ) , (1) ve (2) çözgenleri kullanıldığında X maddesi- X 1 X 2 nin katı adsorbent üzerindeki dağılma katsayılarıdır. AX maddenin molekül büyük- lüğü, e0 0 ve e (1) ve (2) solventlerinin s ıyırma kuvvetleridir. Tablo-2’de alumina 1 2 adsorbent kullan1ld1.1nda çe_itli çözgenlerin n-pentana göre s1y1rma kuvvetleri verilmi_tir. Silika jel’1n e0 de.erleri, alumina için olan de.erlerin 0.77 sine e_ittir. S1y1rma gücü yüksek olan bir çözgen dü_ük olana k1yasla adsorblanan tanecikleri daha h1zl1 s 1y1r1r. Adsorbsiyon kromatografisinde ço.unlukla kademeli s1y1rma yap1l1r. Bunda, s1- y1rma gücü dü_ük bir çözgenle kolayl1kla s1yr1labilen maddeler çekilir. Sonra s1- y1rma gücü yüksek bir çözgen ilave edilerek daha s1k1 ba.l1 maddeler al 1n1r. Tablo-2: Alumina Adsorbenti ile Baz1 Solventlerin S1y1rma Gücü Solvent S1y1rma gücü, e0 Solvent 0 S1y1rma gücü, e Fluoroalkanlar -0.25 Kloroform 0.40 n-Pentan 0.00 Metiletil keton 0.51 Petrol eteri 0.01 Aseton 0.56 Sikloheksan 0.04 Dimetilamin 0.63 Karbon tetraklorür 0.18 Pridin 0.71 n-Propil klorür 0.30 n-Propanol 0.82 Benzen 0.32 Metanol 0.95 Uygulamalar Bile_iklerin adsorblanma e.ilimleri birbirinden büyük farkl1l1klar gösterir ve bu ö- zellik de adsorbsiyon kromatografisinin temelini olu_turur. Örne.in, bir organik molekülün adsorbsiyon özellikleri ile hidroksil gruplar1n1n say1s1 aras 1nda pozitif bir ili_ki oldu.u bilinir. Benzer bir ili_ki çift ba.lar için de söz konusudur. Baz1 fonksi- yonlu gruplar içeren bile_ikler di.erinden daha s1k1 tutulurlar. Adsorblama e.ilimi a_a.1daki s1raya göre azal1r: asid > alkol > karbonil > ester > hidrokarbon. Adsorbsiyon s 1ras1n1n saptanmas1nda adsorbentin yap1s1 da önemlidir. Adsorbent ve solvent seçimi deneme-yan1lma yöntemiyle yap1l1r. ^ekil-11’de HPLC ile yap1- lan tipik bir s1v1-kat1 ay 1rmas1 görülmektedir.

n l o o s s i i t t r r o o k k kolon® 25 cm x 4.6 mm dolgu® 10 mm silikajel n o bas1nç® 225 psi r e t ak1_ h 1z1® 59.8 m/saat s o k hareketli faz® %75 heptan+%25 etanol i t r o k 0 6 12 dakika ^ekil-11: Adrenal steorid-kortizonlar1n s1v1-kat1 kromatografisi 2. Da.1lma (Partition) Kromatografisi Partition (Da.1lma) veya s1v1-s1v1 kromatografisi Martin ve Synge’nin Nobel ödülü- nü kazand1klar1 çal 1_malar1 ile ba_lam1_t1r (1941). Bu çal1_mada tepsi yüksekli.i 0.002 cm kadar küçük olan özel bir kolon haz1rlanabilece.i gösterilmi_tir. Bu du- rumda 10 cm’lik bir kolonda 5000 teorik tepsi bulunabilecektir. Hatta daha k1sa kolonlarda bile yüksek ay1rma gücüne eri_ilebilecektir. Faz 2 Faz 2 madde, yüzeyi kaplayan s1v1 fazda çözünür. Faz 1 Faz 1 www.chem.ufl.edu/~cao/chm4130/ lecture18.ppt

Kat1 Destek Maddeleri Da.1lma kromatografisinde en çok kullan1lan kat1 destek maddeleri silisik asit veya sika jel’dir. Bu madde suyu kuvvetle adsorblar; bu nedenle sabit faz suludur. Baz1 uygulamalarda su filmine bir tampon veya kuvvetli bir asit (veya bir baz) ilavesi ay1rmay1 kuvvetlendirebilir. Alifatik alkoller, glikoller ve nitrometan gibi polar çözgenler de tek ba_lar1na veya su ile kar1_1m halinde silika jel’e emdirilerek sabit faz olarak kullan1l1r. Destek olarak kullan1lan di.er maddeler aras1nda alumina, diyatome topra.1, ni_asta, selüloz ve çok ince (toz) cam say1labilir; bu kat1lar su ve çe_itli organik s1v1larla kaplanarak kullan1l1r. 1. Fosfoserin 2. Aspartik asit 3. Glutamik asit 4. a-Amino adipik asit gradient profili 5. Asparagin 6. Serin 7. Glutamin 8. Histidin 9. Glisin 10. Treonin 11. Sitrullin 12. 1-Metilhistidin 13. 3-Metilhistidin 14. Arginin 15. b_Alanin 16. Alanin 17. Taurin 18. Anserin 19. b-Aminobütirik asit 20. b-Amino-izo-bütirik asi 21. Tyrosin 22. a-Aminobütirik asit 23. Metionin Injeksiyon 24. Valin 25. Triptofan 26. Fenilalanin 27. 0zolusin 47 dakika 28. Lusin 29. g-Hishidroksilysin 30. Lysin http://faculty.atu.edu/abhuiyan/Course/Chem%204414/Chapter%2028.ppt#14 ^ekil-12: 30 amino asit kar1_1m1n1n gradient elusyon yöntemiyle ayr1lmas1

Hareketli faz saf bir çözgen veya çözgenler kar1_1m1d1r; polaritesi sabit faz s1v1- s1ndan, sabit faz ile kar1_mayacak derecede farkl1 olmal 1d1r. Sabit faza emdirilen çözgen kar1_1m1 ço.unlukla, polariteleri yüksek iki çözgendir; “ters-faz” kromatografisinde ise sabit faz polar olmayan bir çözgen, hareketli faz da polar bir çözgendir. Sabit ve hareketli s1v1 çiftlerinin seçimi deneyerek yap1l1r. Daha önce de.inildi.i gibi ay1rman1n verimli olabilmesi için kademeli s1y1rma (gradient elution) uygulan1r. ^ekil-12.de 30 amino asit kar1_1m1n1n gradient elusyon yönte- miyle ayr1lmas1 görülmektedir. Destek Maddesi ile Ba.lanm1_ Dolgu Maddeleri HPLC.de çok kullan1lan bir dolgu maddesi tipi de üzerinde kimyasal olarak ba.- lanm1_ organik bir grup bulunan saf silika jel tanecikleridir. Örne.in, Klorooktadesil silan’1n silika jel yüzeyi üzerinde OH gruplar1 ile reaksiyonundan bir hidrokarbon yüzey olu_ur. Burada R oktodesil grubunu ve daire içindeki Si’de jel taneci.i üzerindeki pek çok SiOH gruplar1ndan birini gösterir. Silika jel’e ba.lanabilen ba_ka gruplar da vard1r; alifatik aminler, eterler, nitratlar ve aromatik hidrokarbonlar gibi. Kimyasal olarak ba.lanm1_ silika, yüzey adsorbsiyonun oldu.u kat1 yüzey ile s 1v1- s1v1 dengesinin olu_tu.u ak1c1 olmayan s 1v1 aras 1nda bulunan bir ara kademedir. Kimyasal olarak ba.l1 yüzeylerin, normal kat 1-destekli s1v1lara göre önemli derece- lerde avantajlar1 vard 1r. Da.1lma kromatografisi ile birbirine çok benzer maddeler ayr1labilir. Tipik örnekler aras1nda bir proteinin hidrolizinden elde edilen çok say1daki amino asitlerin, alifa- tik alkollerin ve _eker türevlerinin analizleri verilebilir.

3. 0yon-De.i_tirme Kromatografi 0yon-de.i_tirici reçineler kolon kromatografisinde çok kullan1lan dolgu maddeleri- dir. Di.er kolon yöntemlerinin tersine burada solvent su, ayr1lacak maddeler de iyonlard1r. Bu nedenle iyon-de.i_tirici kromatografi inorganik kimyasal analizlerde çok kullan1lan bir yöntemdir. Ayni zamanda amino asitlerin ve di.er organik asidlerin ve bazlar1n ayr1lmas1nda da uygundur. örnek iyonu + hareketli anyonlar + + + + + + + anyon de.i_tirici kar_1t iyon – – – – reçine www.chem.ufl.edu/~cao/chm4130/ lecture18.ppt 0yon de.i_tirme, bir çözelti ve bu çözelti ile ili_ki halinde olan fakat çözünmeyen bir kat1 madde aras 1ndaki, ayni i_aretli iyonlar1n birbiri ile yer de.i_tirmesi olay1d1r. Nötral veya sentetik pek çok madde iyon de.i_tirici gibi davran1r. Klay ve zeolitlerin iyon-de.i_tirme özellikleri uzun zamandan beri bilinmekte ve bunlar yüzy1l1 a_k1n bir süredir bu amaçla kullan1lmaktad1r. Sentetik iyon-de.i_tirici reçi- neler ilk defa 1935’de yap1ld1 ve su sertli.inin giderilmesi, suyun deiyonizasyonu ve iyon ay1rma i_lemlerinde geni_ bir uygulama alan 1na yay1ld1. Sentetik iyon-de.i_tirici reçineler, her molekülünde çok say1da iyonik fonksiyonel gruplar içeren yüksek molekül a.1rl1kl1 polimerik maddelerdir. Katyon de.i_tirici reçinelerden sülfonik asit gruplar1 (RSO – + 3 H ) içeren kuvvetli asit reçineleri, karboksilik asit gruplar1 (RCOOH) içeren zay 1f asit reçinelerden daha çok kullan1- l1r. Anyon-de.i_tirici reçinelerde bazik fonksiyonel gruplar bulunur; bunlarda polimer molekülüne ba.lanm1_, ço.unlukla, amin gruplar1 vard 1r. Kuvvetli baz de.i_tiricilerde kuvaterner aminler [RN(CH)+3 – OH ], zay1f baz olanlar1nda ise sekonder veya tersiyer aminler bulunur. Bir katyon-de.i_tirme reaksiyonu a_a.1daki denklemle anlat1labilir.

 – + +x – + + x RSO H + M ¬® (RSO ) M + x H 3 3 x kat1 çözelti kat1 çözelti Burada M+x bir katyonu, R reçine molekülünün kalan k 1sm1n1 gösterir. Anyon de- .i_tiricinin reaksiyonu da benzer bir _ekilde yaz1labilir (A-x anyondur). x RN (CH + – -x -x – ) OH + A ¬® [RN(CH ) ] A + x OH 3 3 3 3 x kat1 çözelti kat1 çözelti 0yon-de.i_tirici reçineler s1y1rma kromatografisinde ba_ar1 ile kullan 1lmaktad1r. Örne.in, Beukenkamp ve Reiman, sulfonik asit reçinesi (asidik hali) ile doldurul- + + mu_ bir kolonla Na ve K iyonlar 1n1 ay 1rabilmi_lerdir. Örnek kolonun tepesinden konuldu.unda her iki alkali iyon için de a_a.1daki reaksiyon olur. + + R H + B ¬® R B + H (1) + + + Burada B , Na veya K iyonlar 1n1 gösterir. 0yon de.i_tirme reaksiyonunun denge sabiti, + [RB] [H ] K = ¾¾¾¾ (2) + [R H] [B ] _ekilde yaz1l1r. Burada [RB] ve [RH] kat1 reçine faz 1ndaki alkali ve hidrojen iyonla- r1n1n konsantrasyonlar1d1r (veya yakla_1k aktiviteleri). Denklem(2) a_a.1daki, [R B] K [R H] ¾¾¾ = ¾¾¾¾ = KD (3) + [B+] [H ] _ekilde yaz1labilir. KD, da.1lma katsay1s1d1r. S1y1rman1n hidroklorik asit ile yap1ld1.1 ko_ullarda KD yakla_1k olarak sabit kal1r, çünkü s1y1r1c1n1n hidrojen iyonu konsant- rasyonu, potasyum ve sodyum iyonlar1na göre çok büyüktür. Reçinenin de.i_tir- me yapabilece.i uçlar1 da örnekdeki alkali metal iyonlar 1 say 1s1ndan çok fazlad1r. + Böylece [H ] ve [RH] 1n toplam konsantrasyonlar1, dengenin kaymas1ndan etki- lenmezler (denklem 1). Buna göre [RH] ve [H+ + ] 1n [RB] ve [B ] ye göre büyük ol- du.u ko_ullarda denklem(3), denklem(1) gibi kullan1labilir ve genel kromatografi teorisi, sabit faz1n iyon de.i_tirici bir reçine oldu.u halde de uygulanabilir. Denklem(3)’deki K + D de.eri reçinenin di.er iyonla k1yasland1.1nda B iyonuna kar_1 + ilgisini gösterir. K büyükse B iyonunun kat 1 fazda kalma e.ilimi artar, tersine K D D nin küçük olmas1 bu e.ilimi azalt1r (buradaki di.er iyon H+ + ‘dir). H gibi çok bilinen bir referans iyon seçilerek bilinen bir reçinede de.i_ik iyonlar1n da.1l1m oranlar1

k1yaslanabilir. Böyle bir inceleme çok de.erlikli iyonlar1n tek de.erlikli iyonlara göre daha s1k1 tutuldu.unu göstermi_tir. Ayn1 de.erlikli iyonlar aras1nda yap1lan incelemelerde ise hidratlanm1_ iyonun, baz 1 özellikleri yan 1nda, büyüklü.ünün de etkin oldu.u gözlenmi_tir. Tipik bir sülfolanm1_ katyon de.i_tirici reçinenin KD de- .erleri a_a.1daki s1raya göre azal1r: Cs+ + + + + + + > Rb > K > NH4 > Na > H > Li . 0ki +2 +2 +2 +2 de.erlikli katyonlar için de _öyle bir s1ra yaz1labilir: Ba > Pb > Sr > Ca > +2 +2 +2 +2 Cd > Cu > Zn > Mg . KD de.erleri yak1n olan iyonlar1n birbirinden ayr1lmas1 için, adsorbsiyon ve da.1l- ma kromatografilerinde uygulanana benzer yöntemler kullan1l1r. Örne.in, ^ekil- 13’de inorganik iyonlar1n sülfonik asitli katyon de.i_tirici bir reçinede (zar dolgu) ayr1lmas1n1 gösteren HPLC kromatogram 1 verilmi_tir. (Li-Cs) F- Konsant- t rasyon ppm a m +2 F- 3 r SO -2 Mg o f HPO -2 4 format 8 4 – Br BrO – 10 Cl- 3 i – s Cl 4 / 4 e i 1 – r s # NO – e – r t 2 NO v NO 10 u p 3 3 o p r C . ö HPO -2 30 / 8 t 4 n 2 +2 k a 0 y2 – Ca e – i BrO3 t Br 30 u % e h r d – b e +2 NO 30 a t Sr 3 / p u a -2 d h SO 25 e. C 4 / u 4 +2 t 1 Ba+2 Ca 3 a. 4 y4 t +2 l 0 Mg 3 u 2 c a % +2 f / S 10 / m : e p t h +2 t Ba 25 h C Zaman, dakika Zaman, dakika (a) (b) ^ekil-13: 0norganik iyonlar1n iyon de.i_tirici kromatografiyle ayr1lmas1

S1y1r1c1 iyonlar 1n analit içinde kalmamas1 için analitik kolondan sonra bir s 1y1r1c1 kolon bulundurulur. Katyonlar1n ayr1lmas1nda s1y1r1c1 bir anyon-de.i_tirici reçine- nin hidroksiti ile doldurulur. Bu reçine HCL s1y1r1c1 çözeltiyi, katyonlar1 etkilemeden adsorblayabilir. S1y1r1c1 kolondaki reaksiyon a_a.1daki gibidir. + – H + Cl + ROH ¾® RCl + H O 2 Anyonlar 1n ayr1lmas1ndaki reaksiyon da, + – Na + HCO + RH ¾® RNa + H CO 3 2 3 _eklindedir. Burada H CO ‘ 1n çözgenin iletkenli.ine önemli bir tesiri yoktur. 2 3 0yon-de.i_tirici kromatografisi en çok amino asitlerin analizinde kullan1l1r. Örne.in, ^ekil-14’de, her birinden 1.0 x 10-8 mol bulunan 17 amino asit kar 1_1m1n1n kromatogram1 verilmi_tir. Ay1rma zaman1 sadece 42 dakikad 1r. De.i_ik pH larda tamponlar kullan1larak kademeli s1y1rma uygulanm1_t1r. n i n t i o n s y i i s a t e ö k l i o t m k r z a i a n n y p i i n n s n r n i i n a e i d s o o s t s i y e i ö t l m r s l s i t a i a l h a k y i n n m i i s n s a i i t l n n r u g i n l n i a ö s l t g a a k l o a r l e i t y n e n t e ) i D l f m a n v n 0 n i i n 7 t i s g 5 i r ( s a n i l o r p Zaman, dakika http://faculty.atu.edu/abhuiyan/Course/Chem%204414/Chapter%2028.ppt#14 ^ekil-14: Amino asitlerin bir iyon-de.i_tirici kolonda ay1lmas1

4. Jel geçirgenlik veya Jel süzme (Moleküler-Exclusion veya Size-Exclusion) Kromatografi) Jel kromatografisi ay1rmay1 örnekteki maddelerin molekül büyüklüklerine göre yapan bir kromatografi tekni.idir. Bu tekni.e çe_itli adlar verilmi_tir; jel geçirme (gel permeation) kromatografisi, ç1karma (exclusion) kromatografisi ve moleküler- elek (molecular sieve) kromatografisi gibi. Moleküler Ç1karma, Jel Geçirme, Jel Standart Entropi Etkisi Filtrasyon Kromatografileri ç1kan büyük moleküller 2a2a2a2a 2222 KKK === 1- 1-1-1- dddd cccc www.chem.ufl.edu/~cao/chm4130/lecture18.ppt Jel kromatografisi, bir kolonda, s1y1rma yöntemiyle yap1l1r. Burada maddenin ç1k- ma derecesi, madde molekülleri veya iyonlar1n1n çözelti faz1na olan giriciliklerine ba.l1d1r; çözelti, porozitesi yüksek jel yap1l1 dolgu maddesi içinde tutulmu_tur. Jelin gözeneklerinden daha büyük olan moleküller veya iyonlar1n tamam1 kolon- dan ç1karlar, daha küçüklerinin ç1k1_1 ise küçüklü.ünün derecesine, _ekline ve bazan da jel taraf1ndan adsorblanma e.ilimlerine göre de.i_ir. Kolon Dolgusu Jel kromatografisindeki sabit faz, su adsorbsiyonu (bazan ba_ka çözgenler) fazla olan ve _i_ebilen, küçük tanecikler halinde, poröz bir polimerik maddedir. Çal1_- maya haz1rlanm1_ dolgu maddesinde polimer a.1 içinde tutulmu_ büyük miktarda

çözgen vard1r. ^i_en gözeneklerin ortalama büyüklükleri adsorplanan çözgenin miktar1na ba.l1d1r; bu ise, polimer moleküllerindeki çapraz ba. miktar 1 ile saptan 1r. Çok kullan1lan bir polimer, polisakkarid dekstran’1n epiklorhidrin ile çaprazba.- lanmas1yla haz1rlan1r. Epiklorhidrin miktar1n1n de.i_tirilmesiyle gözenek büyüklükleri farkl1 bir seri polimer elde edilebilir. Bu jeller Sephadex ticari ad 1 al- t1nda sat1lmaktad1r. Tablo-3’de Sephadex jellerinden baz1lar1n1n özellikleri veril- mi_tir. Metilen birakrilamid ile çapraz-ba.lanm1_ poliakrilamid’den haz 1rlanm1_ reçineler de di.er bir grup ticari reçinelerdir. Tablo-3: Ticari Sephadex Jellerin Özellileri Hacim ili_kisi, ml/g, orijinal jel(a) Yakla_1k ç1kma Jel tan1m1 V V V s1n1r1, mol.a.. g i 0 G-10 0.6 1.0 0.9 700 G-15 0.6 1.5 0.9 1500 G-25 0.5 2.5 2 5000 G-50 1 5 4 10000 G-75 1 7 5 50000 G-100 1 10 6 100000 G-150 1 15 8 15000 G-200 1 20 9 200000 (a) V kat1 jel matriksin kaplad11 hacim, V : gözeneklerde tutulan solvent hacmi, g i V0: jel tanecikleri aras1ndaki s1v1 hacmi Jel Kromatografisinin Teorisi Suyla veya bir çözgenle _i_irilmi_ bir jel ile doldurulan kolonun toplam hacmi a_a- .1daki ifade ile verilir. V = V + V + V t g i 0 V jelin kat 1 matriksinin kaplad 1.1 alan, V jel gözenekleri içinde tutulan çözgen g i hacmi, V0 jel tanecikleri d 1_1nda kalan hacimdir. Bir kar1_ma veya difüzyon olma- d1.1 vasay 1ld1.1nda, V0 ayn 1 zamanda, maddeleri jel gözenekleri içine ta_1yan solvent miktar1n1 gösterir. Gerçekte ise bir miktar kar 1_ma ve difüzyon olay1 vard 1r ve bu nedenle de Gaussian-_ekilli e.ride yer alan maddeler V0 .da bir maksimum

verirler. Jel gözenekleri içine kolayl1kla girebilecek küçüklükteki moleküller için bu maksimum kolonun sonunda ve V + V de.erinde meydana gelir. V , V ve V i 0 i 0 g büyüklükleri, ço.unlukla birbirine yak1nd1r; bu da, bir jel kolonu ile bir örnekteki büyük moleküllerin küçük moleküllerden ayr1lmas1 i_leminde kullan1lan y1kama s1v1s1n1n çok az oldu.unu gösterir. Büyüklükleri orta derecelerde olan moleküller gözeneklerde tutulan çözgenin bir k1sm1na girebilirler; bu fraksiyon K ile gösterilirse s 1y1r1c1 hacmi V için a_a.1daki d e e_itlik yaz1labilir. V = V + K V (4) e 0 d i Bu denklem bir jel kolonunun tüm maddelere kar_1 davran 1_1n1 tan 1mlayabilir. Jel gözeneklerinden geçemeyecek kadar büyük moleküller için K = 0 ve V = V d 1r; d e 0 gözeneklere girebilen maddeler için ise K = 1 ve V = V +V dir. Denklem(4) ün d e 0 i yaz1lmas1nda madde molekülleri ve jel yüzeyleri aras1nda adsobsiyon gibi etkile- _imlerin olmad1.1 varsay 1lm1_t1r. Bu tür etkile_imler varsa, gözeneklerde tutulan madde miktar1 artar; gözeneklere kolayl 1kla girebilen maddeler için Kd > 1 olur. Tablo-4’de dekstrant-tipli jeller için deneysel olarak saptanan Kd de.erleri verilmi_- tir. Tablo-4: Sephadex Jellerin Kd De.erleri K d Yakla_1k Sephadex Sephadex Sephadex Sephadex Madde mol a.. G-25 G-75 G-100 G-200 Amonyum sülfat 132 0.9 – – – Potasyum klorür 74 1.0 – – – Titiptofan 204 2.2 1.2 – – Glisin 76 0.9 1.0 – – Ribonükleas 13000 0 0.4 – – Tripsin 24000 0 0.3 0.5 0.7 Serum albumin 75000 0 0 0.2 0.4 Fibrinojen 330000 0 0 0.0 0.0

Jel Kromatografisi Uygulamalar1 Sephadex G-25 ve G-50 gibi, çok s1k1 çapraz ba.l1 ve küçük gözenekli jeller tuz giderme i_lemlerinde, veya yüksek molekül a.1rl1kl1 do.al-maddelerden dü_ük molekül a.1rl1kl1 molekülleri ay 1rmada kullan1l1r. Tablo-4’deki de.erlerden de anla- _1ld1.1 gibi G-25 jeli tuzlar 1 ve proteinlerden amino asitleri kolayl 1kla ay1rabilir. Bu- rada, dü_ük molekül a.1rl1kl1 moleküllerin K de.erleri 1’e yakla_1rken, K de.eri d d s1f1r olan proteinler jelden tümüyle ç1kar1l1rlar. Sonuçta, büyük hacimlerde (yatak toplam hacminin % 20-30’u) örneklerle çal1_1lmas1 halinde bile iyi bir ayr 1lma elde edilir. Böyle bir ay1rma, bir sellofan membrandan yap1lan diyalize benzer, fakat daha h1zl1 ve daha uygun bir ay1rma yöntemidir. Sephadex G-25 ve G-50 jelleri, Tablo-4’de verilen proteinler ile dü_ük molekül a.1rl1kl1 maddeler aras 1nda bulunan büyüklüklerdeki peptidlerin ayr1lmas1nda da uygundur. Bu bile_iklerin K d de.erleri 0’dan büyük 1’den küçüktür. Tablo-4’deki çok gözenekli jeller, proteinler, nükleik asitler ve polisakkaridler gibi makromoleküllerin ayr1lmas1 ve safla_t1r1lmas1nda kullan1l1rlar; Sephadex 75, tripsin, pepsin ve sytokrom C’nin, serum, albumin, hemaglobin ve fibrinofen gibi yüksek molekül a.1rl1kl1 proteinlerden ayr 1lmas1nda kullan1labilir. Jel-geçirme kromatografisi, polimer kimyac1lar1 ve biyokimyac 1lar taraf1ndan bü- yük moleküllerin molekül a.1rl1klar1n1 saptamada kullan1lmaktad1r. Burada, bilin- meyen maddenin s1yr1lan hacmi, ayni kimyasal özelliklerdeki bir seri standart maddenin s1yr1lan hacimleri ile k1yaslan1r. Di.er baz1 s 1v1 kromatografileri: Afinite (veya Bioafinite) Kromatografi: Bu yöntemde proteinlerin, enzimler gibi özel ligandlara kar_1 afinitelerinden (benze_im) yararlan1l1r. Ligand, selüloz gibi uygun bir polisakkarid polimere ba.lan1r. Afinite kromatografi biyomoleküllerin safla_t1r1lmas1nda kullan1l1r. Zone Elektroforez: Zone elektroforez bir elektroforetik tekniktir; bile_ikler bir tam- ponda zonlar veya bandlar olarak ayr1l1rlar ve kat1, poröz, veya uygun di.er bir destek ortam1nda (filtre ka.1d1, agar jel, poliakrilamid jel gibi) kararl1 hale dönü_tü- rülür.

Chiral Kromatografi: Enantiomerlerin ayr 1lmas1nda kullan1lan bir tekniktir; bir enentiomere kar_1 di.erinden daha fazla aktif olan ve reaksiyona girebilen bir chiral sabit faz kullan1l1r. YÜKSEK-PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAF0 GAZ-SIVI KROMATOGRAF0 KIYASLAMASI Yüksek-performansl 1 s 1v1 kromatografisi (HPLC) ve gaz-s 1v1 kromatografisi ara- s1ndaki k1yaslama Tablo-5’de verilmi_tir. Her ikisinin de uygulanabildi.i durumlar- da, gaz, s1v1 kromatografisi tercih edilir, çünkü gaz-s 1v1 kromatografisi cihaz 1 çok basittir ve sonuçlar daha h1zl1 al 1n1r. Uçucu olmayan maddeler (inorganik tuzlar da dahil) ve s1cakl1kla bozunabilen karars1z bile_ikler gaz-s1v1 kromatografisi ile ana- liz edilemezler, ancak HPLC yöntemi uygulanabilir. Bu iki kromatografik yöntem, ço.unlukla, birbirlerini tamamlarlar. Tablo-5: Yüksek-Performans S1v1 ve Gaz-S1v1 Kromatografilerinin K1yaslamas1 Verimli, seçicili.i yüksek, kullan1m alan1 geni_tir Her iki yöntemin ortak özellik- Az miktarda örnekle çal 1_1labilir leri Örnek bozunmadan kal1r Kantitatif analizlerde kullan1labilir Yüksek-performans s 1v1 Uçucu olmayan ve 1s1l kararl1l1.1 olmayan kromatografisinin özel avantaj- örneklere uygulanabilir lar1 0norganik iyonlar1n analizleri yap1labilir Gaz-s1v1 kromatografisinin Cihaz basittir, ucuzdur özel avantajlar1 Analiz sonuçlar 1 h 1zl1 al 1n1r

2. DÜZLEM KROMATOGRAF0S0 Düzlem kromatografisi iki tiptir. Bunlardan biri ince-tabaka kromatografisidir; ay1r- ma, düz bir yüzey üzerinde bulunan ince toz halindeki kat1 bir tabakada da yap1l1r. Di.eri ka.1t kromatografisidir; burada ay1rma ortam1, a.1r bir filtre ka.1d1ndan yap1lm1_ bir _erit veya sayfad1r. Ka.1t kromatografisi ilk olarak 19. yüzy1l1n ortalar1nda kullan1lm1_t1r. 1940’l1 y 1llar- da çe_itli sahalara uygulanabilen bir teknik olarak geli_tirilmi_tir. 0nce-tabaka kromatografisinin geli_mesi 1950 y1llar1nda olmu_ ve k 1sa sürede di.erinden daha çok kullan1m alan1na yay1lm1_t1r. Ka.1t ve ince-tabaka kromatografileri kompleks inorganik, organik, ve biyokimyasal maddeleri ay1rma ve tan1mlamada kullan1lan basit ve ucuz yöntemlerdir. Hatta (özellikle ince tabaka kromatografisi), bu tip kar1_1mlar1n kantitatif analizlerinde bile kullan1labilirler. Genel 0lkeler Düzlem kromatografide, örne.in bulundu.u bir damla çözelti sabit faz1n düzlem yüzeyi üzerinde bir noktaya damlat1l1r. Çözgenin buharla_mas1ndan sonra, yüzey boyunca hareketli bir faz (y1kay1c1, developer) ak1_1yla kromatogram y1kan1r. Y1- kay1c1n1n hareketini kapiler kuvvetler sa.lar. “Yukar1 y 1kama”da hareketli faz yuka- r1 do.ru gider; radyal y1kamada y1kay1c1 bir merkezden ba_layarak daireler halin- de ilerler. “A_a.1 y 1kama”da hareket a_a.1 do.rudur, bunda solventin ak1_1na a.1rl1.1 da yard 1mc1 olur. Düzlem kromatografisinde denge konumu, kullan1lan s1v1-s1v1 tipine ba.l1 olarak de.i_ir. Ço.unlukla sabit faz su veya polar ba_ka bir s1v1d1r. Kolon kromatografisinde ilk geli_tirilen ilkeler ka.1t ve ince-tabaka ortamlar1na da uygulanabilir. Bu ortamlar içinde sabit ve hareketli fazlar aras 1nda tekrar tekrar madde transferi lolur. Maddenin hareket h1z1 da.1lma katsay1s1na ba.l1d1r. CS K = ¾¾ CM Tek bir taneci.in fazlar aras1nda gezinmesi, taneci.in gecikme fatörü (R F) Maddenin hareket mesafesi R F = ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾ Çözgenin hareket mesafesi

Kontrol edilemeyen de.i_kenleri dengeleyebilmek için bir maddenin dola_t1.1 me- safe, ayn1 ko_ullarda standart bir maddeninki ile k1yaslan1r. Bu iki mesafe aras1n- daki oran R std _eklinde tan1mlan1r. 1. 0nce-Tabaka Kromatografisi Sabit Faz 0nce-tabaka kromatografisinde kullan1lan kat1 adsorblay 1c1lar, kimyasal bile_im ve tanecik büyüklü.ü bak1m1ndan çe_itli tipteki kolon kromatografilerinde kullan1lananlara benzer. Ençok kullan1lan adsorblay1c1, s1v1- s1v1 ay 1rmas1nda su veya di.er polar çözgenler için bir destek malzemesi görevi yapan silikajel’dir. Haz1rlad1ktan sonra kurutulan silika tabakas1 neminin ço.unu kaybedip kat1 bir tabaka haline dönü_türülerek s1v1-kat1 ay 1rmalar1nda da kullan1labilir. Böyle bir kurutma i_lemi yap1l1rken silika yüzeyinin atmosfere aç1k olmamas1na dikkat edil- melidir; aksi halde yüzey birkaç dakika içinde tekrar nem çekerek destek malze- mesinin (silika jel) s1v1-s1v1 ay 1rmas1 yapabilecek _ekle dönü_mesine neden olur. 0yon de.i_tirici reçineler ve Sephadex jelleri de ince-tabaka kromatografisinde sabit faz olarak kullan1labilirler. 0nce-Tabaka levhalar1n1n Haz1rlanmas1 Bir ince-tabaka levhas1 bir cam veya “mylar” levhas 1 veya mikroskop k 1za.1 üzeri- ne, çok ince toz halindeki kat1 maddenin sulu bir kar 1_1m1 (çamur) yay 1larak haz1r- lan1r. Kat1 taneciklerin levha üzerine ve birbirine tutunmas 1 için kar 1_1m içine, ço- .unlukla, bir ba.lay1c1 konulur, kar 1_1m1n levha üzerinde yay1lmas1 ve yüzeye s1k1ca yerle_mesi için levha bir süre bekletilir; bazan da bir etüvde bir kaç saat 1s1t1l1r. 0nce tabaka üzerinde maddelerin iyi ve temiz bir _ekilde ayr1labilmesi, levhan1n kapland1.1 maddenin tanecik büyüklü.ü da.1l1m1na ve tabaka kal1nl1.1n1n düzgün- lü.üne ba.l1d1r. Sabit kal1nl1kta bir tabaka olu_turmak için çe_itli sürme yöntemleri geli_tirilmi_tir. Çe_itli firmalar kaplanm1_ halde levhalar pazarlamaktad 1r.

Levhan1n Develope Edilmesi 0nce-tabaka levhalar1n1n develope edilmesinde uygulanan tipik i_lemler ^ekil- 11’de gösterilmi_tir. Levhalar, ço.unlukla, 5x20x20 cm. boyutlar1ndad1r. Levhan1n bir ucu yak1n1na bir damla örnek konur ve yeri bir kalem ile i_aretlenir. Örne.in çözücüsü buharla_t1r1l1r ve levha, develope edecek madde buharlar1 ile doyurul- mu_ kapal 1 bir kap içine konur. Levhan 1n bir ucu, ^ekil-15’deki yöntemlerden biri- ne göre, develop çözücüsüyle nemlendirilir (örnek develop solventine dald1r1l1r). Developer levhan1n tümünü geçtikten sonra levha ç1kar1l1r, kurutulur ve üzerinde ayr1lm1_ olan maddeler uygun bir yöntemle tan 1mlan1r. ^ekil-16’da, bir kar1_1mdaki amino asitlerin iki yönde develope edilerek ayr1lmas1 görülmektedir (iki-yönlü düzlem kromatografisi). Örnek kare _eklindeki levhan1n bir kö_esine konur ve önce A çözücüsü kullan1larak yukar1 ak 1_ yöntemiyle develope edilir. B çözücüsü konulur ve tekrar yukar1 ak 1_ ile develop edilir. B çö- zücüsü de uzakla_t1r1ld1ktan sonra levhaya, amino asitlerle pembeden mora kadar de.i_en renkler olu_turan ninhidrin maddesi yay1larak amino asitlerin konumlar1 belirlenir. Saptanan lekeler, standart örneklerdeki amino asitlerin konumlar1 ile k1yaslanarak teh_is edilir. W S ak1_ C C W S C W D ak1_ ak1_ S (a) (b) (c) ^ekil-15: 0nce tabaka kromatografisi için üç tip sistem; (a) yukar1 ak1_l1, (b) a_a.1 ak1_l1, (c) yatay ak1_l1, S: örne.in ba_lang1çtaki konumu, D: developer, C: kromatografik yüzey, W: pamuk fitil

10 amino asitler: 9 1. aspartik asit A 7 8 2. glutamik asit , 3. serin ü c 6 4. b-alanin ü z 5. glisin ö Ç 5 6. alanin 4 7. metionin 8. valiin 3 9. i-leusin 10. sistein x örnek, ba_lang1çta 1 2 Çözücü, B ^ekil-16: Baz1 amino asitlerin iki yönlü ince-tabaka kromatogram1; A: toluen-2- kloroetanol-pridin, B: kloroform-benzil alkol-asetik asit Taneciklerin Tan1mlanmas1 Ay 1rma i_leminden sonra örnekteki maddelerin yerlerini belirlemek için çe_itli yön- temler uygulan1r. Bunlardan en çok kullan1lan ve pek çok organik kar1_1mlarda uygulanabilen iki yöntemde iyod veya sülfürik asit çözeltileri kullan1l1r. Çözelti levha üzerine yay1ld1.1nda organik maddelerle koyu renkli ürünler vererek reaksi- yona girer. Ninhidrin gibi baz1 özel maddeler de kullan 1labilir. Ayr1lma i_leminde fluoresans maddeler olu_uyorsa bunlar1n tan1mlanmas1 UV bir lamba ile yap 1labi- lir; veya, sabit faza fluoresans bir madde konularak develope i_leminden sonra levha UV bir lamba alt1nda incelenebilir. Kantitatif Analiz Levha üzerinde aç1.a ç1kan leke alanlar1n1 daha önce haz 1rlanm1_ olan standart- lar1n alanlar1yla k1yaslayarak yar1 kantitatif sonuçlar al 1nabilir. Daha iyi ve hassas sonuçlar için levha üzerindeki leke kaz1narak al1n1r, ekstraksiyon ile madde kat1 k1s1mdan ayr1l1r ve uygun bir fiziksel veya kimyasal yöntemle analiz edilir. Bir ba_- ka metot da lekeden, fluoresans veya yans1ma yoluyla ç1kan 1_1n1n bir densitometre ile ölçülmesidir.

2. Ka.1t Kromatografisi Ka.1t kromatografisi ile yap1lan ay1rmalar ince-tabaka levhalar1na benzer _ekilde- dir. Burada çok saf, porozitesi ve kal1nl1.1 düzgün ve ayni kaliteli ka.1tlar kullan1l1r. Bu ka.1tlar yeterli miktarda su adsorblanm1_lard1r ve s1v1-s1v1 tip kromatografi s1n1f1nda bulunurlar. Su yerine ba_ka s1v1lar1 adsorblam 1_ ka.1tlar da olabilir, bun- larda sabit faz farkl1d1r. Örne.in, silikon ya.1 veya parafin ile i_lem görmü_ bir ka.1tla, ters-faz ka.1t kromatografisi yap1labilir; bunda hareketli faz polar bir solventtir. Bir adsorbent veya iyon-de.i_tirici reçine içeren özel ka.1tlar da vard1r; bunlar adsorbsiyon ve iyon-de.i_tirici ka.1t kromatografisi olarak kullan1l1r.

3. ELEKTROFOREZ VE ELEKTROKROMATOGRAF0 Elektroforez, bir elektrik alan1n1n etkisi alt1nda bulunan bir çözeltideki taneciklerin göç etmesi _eklinde tarif edilir. Eskiden, bu taneciklerin kolloidal olduklar1 ve adsorblad1klar1 iyonlar nedeniyle yüklü hale geldikleri kabul edilirdi. Böyle bir ta- n1mlama bugün için fazla ba.lay1c1 bulunmaktad 1r ve elektroforez terimi iyonlara da kolloidal taneciklere de uygulanabilen bir tan1m olarak kabul edilmektedir. Elektroforetik yöntemlerle bir kar1_1mdaki maddeler, agregatlar (yap1_1k veya bir arada toplanm1_ gruplar) halinde veya tek tek ayr 1labilir. Elektroforetik yöntemler ay1rma i_leminin, bir destek veya sabitleyici ortam1n bu- lunmad1.1 hallerde yap 1lmas1na göre iki gruba ayr1l1r. “Serbest-çözelti” yöntemin- de örnek çözeltisi, bir tampon s1v1 ile doldurulmu_ U-tüpünün taban 1na topluca konulur. Tüp uçlar1n1n yak1n1na yerle_tirilen elektrotlarla bir elektrik alan1 uygula- n1r; yüklenen taneciklerin farkl1 h 1zlarla elektrotlardan birine veya di.erine do.ru hareket ettikleri gözlenir. Farkl1 göç h 1zlar1 sonucunda ayr1lma olur; bu h1zlar, or- tamdaki taneciklerin yük/kütle oranlar1 ile yap 1sal hareketliliklerine de ba.l1d1r. Serbest-çözelti yöntemi, Tiselius taraf1ndan geli_tirilmi_ ve proteinlerin ayr 1lma- s1nda kullan1lm1_t1r; bu çal1_mas1yla Tiselius 1948 Nobel ödülünü kazanm1_t1r. Yöntem, biyokimyan 1n geli_mesinde bir ba_lang1ç olmu_tur; ancak baz1 deneysel sorunlar nedeniyle geni_ bir uygulama alan 1na yay1lamam1_t1r. Bu sorunlar ayr1lan maddelerin, konveksiyonla, yo.unlukla ve mekanik titre_imlerle birbirine kar1_ma e.ilimlerinden kaynaklanmaktad1r. Ayr1ca ayr1lan madde bandlar1n1 saptayacak çok hassas optik sistemlere de gereksinim vard1r. Ay 1rma i_leminin bir ka.1t, çok ince bir kat1 tabaka veya uygun bir kat 1 madde ile doldurulmu_ bir kolon gibi sabitleyici bir ortamda yap 1lmas1 halinde, serbest- çözeltili elektroforez i_lemlerinde kar_1la_an pek çok sorun giderilebilir. Bu yön- temde, daha önce anlat1lm1_ olan çe_itli kromatografik yöntemlere ilave olarak elektrik alan1 bulunur. Ortam 1n özelliklerine ba.l1 olarak ay 1rma, elektroforetik etkiler sonucunda veya elektroforez ile adsorbsiyon, iyon-de.i_tirme, veya di.er da.1lma dengelerinin birle_imi sonucunda olu_ur. Sabitleyici bir ortamdaki elektroforeze dayanan ay1rma yöntemlerine çe_itli adlar verilir; bunlar, elektrokromatografi, zone elektroforez, elektrogöç ve iyonoforez’ dir. Burada anla- t1lan elektrokromatografidir.

Elektrokromatografik Deney Yöntemleri Elektrokromatografide kullan1lan kat1 ortamlar çok ve çe_itlidir. Ka.1t, selüloz ase- tat membranlar, selüloz tozlar, ni_asta jelleri, iyon de.i_tirici reçineler, cam tozlar1, ve agar jelleri örnek olarak say1labilir. Kat1n1n fiziksel yap1s1na ba.l1 olarak ay 1rma i_lemleri ka.1t _eritler, membranlar, kolonlar, tepsiler, cam veya plastikle destek- lenmi_ ince tabakalarda yap 1labilir. Baz1 dezavantajlar 1 olmas 1na kar_1n filtre ka- .1d1 ve selüloz asetat en fazla kullan 1lan sabitle_tiricilerdir. ^ekil-17’de ka.1t elektroferezinde uygulanan yöntemlerden üçünün _ematik di- yagram1 görülmektedir. ^ekil-17a’daki yöntemde bir ka.1t _erit, tampon bir kar1- _1mla doldurulmu_ iki kap aras 1na yatay olarak yerle_tirilmi_ ve uçlar 1 tampon çözeltilere dald1r1lm1_t1r. Buharla_ma olmamas1 için cihaz hava-geçirmez bir sis- tem içinde bulundurulur. Örnek _eritin merkezine toplu olarak konur ve iki elektrod aras1na 100-1000 V aral1.1nda bir do.ru ak1m uygulan1r. Elektrod reaksiyonlar1n1n ka.1ttaki tamponun bile_imini de.i_tirmemesi için, elektrodlar izole edilir. Miliamper seviyelerinde ak1mlar gözlenir. Uygun bir elektroliz periodu sonunda ka.1t ç1kar1l1r, kurutulur ve kolorimetrik maddelerle olu_an bandlar tan1mlan1r. ^ekil-17b’de ters-V biçiminde bir düzen görülmektedir. Burada örnek V’ nin tepe noktas1na konur; katyonik tanecikler V’nin bir kolundan, anyonik olanlar da di.er kolundan akarlar. ^ekil-17c’deki cihaz ise iki-yönlü elektrokromatografi yöntemine göre çal1_1r. Lev- ha _eklindeki ka.1t dikey olarak yerle_tirilmi_tir; örnek tamponlanm1_ bir çözgenle levhadan a_a.1 do.ru ta_1n1r. Hareketli ve sabit fazlar aras1ndaki da.1lma farkl1l1.1 sonucunda dik yönde ayr1lma olu_ur. Ayr1ca, çözeltinin ak1_ yönüne dik yönde uygulanan bir elektrik ak1m1 ile yatay eksen boyunca da de.i_ik h1zlarda elektrogöç olur. Böylece örnekteki maddeler, örne.in verildi.i noktadan ba_layan radyal birer yol boyunca birbirlerinden ayr1l1rlar. ^ekil-17c’deki yöntem hem analitik hem de preparatif uygulamalarda kullan 1lmak- tad1r. Analitik uygulamalarda ka.1d1n alabilece.i kadar tampon çözelti kullan1l1r; deney sonunda ka.1t ç1kar1l1r, kurutulur ve tan1mlama çözeltileri uygulan1r. Preparatif uygulamalarda ise tampon çözeltinin ak1_1 sürdürülerek her madde tüpler içinde toplan1r.

örnek verme noktas1 hava geçirmez bölge elektrot elektrot filtre filtre ka.1d1 ka.1d1 tampon tampon çözelti çözelti (a) (b) örnek elektrot tampon çözelti rezervuar1 örnekteki maddeler filtre ka.1d1 (c) örnek toplama ^ekil-17: Ka.1t kromatografisinde kullan1lan baz1 cihaz tipleri Elektrokromatografi Uygulamalar1 Elektrokromatografik analiz yöntemleri, çok çe_itli biyolojik maddeleri ay1rmak zorunda olan biyokimyac1lar ve klinik kimyac1lar1 için çok önemlidir. En çok kulla- n1m yeri klinik te_hislerdir; proteinler, serum, urin, mi.de suyu ve di.er vücut sula- r1ndaki büyük moleküller elektrokromatografi ile ayr1labilir. Elektrokromatografi, alkaloidler, antibiyotikler, nükleik asitler, vitaminler, do.al pigmentler, steroidler, aminoasitler, karbohidratlar ve organik asitler gibi küçük moleküllerin ayr1lmas1nda da kullan1l1r. 0norganik iyonlar1n ayr1lmas1nda da elektrokromatografi önemli bir cihazd1r. ^ekil- 18a’da bir kompleksten alt1 metal iyonunun ayr 1lmas1 görülmektedir. Kompleks iyonun yüküne ba.l1 olarak anodik veya katodik göçmeler olmu_tur. Ayr1ca ni- kel(2) iyonunun hareketi, dimetilglioksim çökele.i ile geciktirilmi_tir. Çözeltide

katyonlar (0.05 M), 0.1 M tartarik asit içinde, y1kama s1v1s1: 0.01 M amonyum tar- tarat, 0.05 M dimetil glioksimde ve 4 M amonyakta kar1_1m1d1r. ^ekil-18b’de örnekdeki maddelerin, sürekli elektroforez ve s1y1rma i_lemi s1ras1n- da izledikleri yol gösterilmi_tir. Ka.1d1n taban k1sm1na konulan uygun kaplar içinde her fraksiyon ayr1 ayr 1 toplanabilir. Çözeltie her biri 0.05 M olan As(III), Sb(III) ve Sn(III) iyonlar1 ile 0.02 M tartarik asit0.04 M laktik asit ve 0.04 M l-alanin vard 1r. elektrot Ni lekeler(a) ve m iyonlar1n (b) izledi.i c Cd yollar, hidrojen 0 Fe 2 sülfür ile Ag Sb belirlenmi_tir Sn Cu Co As 300 V, 95 mA uygulanm1_t1r (a) 160 V, 100 mA, 20 dak. (b) 300 V, 95 mA, 20 da. ^ekil-18: 0norganik iyonlar1n elektrokromatogramlar1 Yararlan1lan Kaynaklar Principles of Instrumental Analysis, D.A.Skoog, D.M. West, II. Ed. 1981

…