Etiket Arşivleri: Nutrient Agar

Lab Procedures Part I. Staining and Colony Morphology

Ex. 1-1 Types of Media

Nutrient agar and nutrient broth are common media used in maintaining bacterial cultures. They contain nutrients such as proteins, carbohydrates (sugars), and various lipids. Solid media contains agar, a thickening agent that does not melt at high temperatures (this allows us to incubate the bacteria to facilitate growth); bacteria grow on the surface of solid media. Preparation of media involves making solutions and then autoclaving them at 121oC, 15 psi, for 15 minutes to kill all bacteria including thermophiles (heat loving bacteria) and those that produce resistant endospores (the increased pressure gets the temperature above boiling). This will insure that the media is sterile before inoculation. After autoclaving, media can be dispensed into petri dishes/test tubes and cooled.

Examine different kinds of media: nutrient broth tubes, nutrient agar slants, nutrient agar deeps, agar plates

What would be the advantage of growing bacteria on a slant, rather than on a deep?

Ex. 2-1 Ubiquity

Work in groups of 4

Each group needs 4 agar plates

Label each plate on edge of plate with: name, date, experiment #, type of exposure

Plate 1 – open and place on top of bench; expose to air for 30 minutes.

Plate 2 – Divide plate in half (write on bottom of plate with sharpie marker; label one half of plate with a “B” (before);

label the other half with an “A” (after); touch agar on “B” side with a dirty finger; wash hands with antibacterial soap, then touch agar on “A” side with clean finger

Plate 3 – kiss agar

Plate 4 – dip a sterile swab in sterile water (found in test tubes); swab bench top; dispose of swab in trash.

Incubate: Plates 1 & 4 at 30oC; Incubate: Plates 2 & 3 at 37oC.

Ex. 3-1 Introduction to the Light Microscope

Read/discuss Intro. Microscope Handout

Clean microscope before viewing slides


Food Microbiology Laboratory Plating Techniques ( Dr. Olcay BOYACIOĞLU )

Experiment 1:

Plating techniques

Principles of the Procedure Nutrient Agar consists of peptone, beef extract, and agar. This relatively simple formulation provides   the nutrients necessary for the growth of a large number of microorganisms that are not excessively   fastidious. The beef extract contains water-soluble substances including carbohydrates, vitamins, organic nitrogen compounds, and salts.  Peptones are the principle sources of organic nitrogen,   particularly amino acids and long-chained peptides. Agar is the solidifying agent.

Kaynak

Culture Formulations

Adi Sıvı Besi Yeri(Adi Buyyon)

Bileşimi: Yağsız sığır kıyması………………………500 g
Pepton………………………………………10 g pH= 7.2-7.4
Tuz (NaCl)……………………………………5 g
Su……………………………………………1000cc(L)
Hazırlanışı:500g yağsız sığır kıymasına 1 L saf su konur ve serin bir yerde 2 saat bekletilir. Bir saat yavaş yavaş karıştırılarak kaynatılır. Süzülür. Sıcakken pepton ve tuz eritilir. Eksilen su kadar saf su konup litreye tamamlanır. pH’sı 7,2–7,4’e ayarlanır. Deney tüplerine 15 ml kadar dağıtılır. Tüplerin ağızları pamuklanıp, 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir

Katı Besi Yeri(Adi Agar)

Bileşimi: Adi Buyyon…………………………………1000cc(L)
Agar………………………………………… 15 g pH =7.2-7.4
Hazırlanışı: Cam balondaki adi buyyona tartılan agar katılır. Agar eriyene kadar karıştırılarak kaynar su banyosunda tutulur. pH’ı 7.2–7.4’e ayarlanır. Balonun ağzı pamuklanıp, otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir. Sıcakken, besi yeri henüz katılaşmadan steril petri kutularına 15–20 ml boşaltılıp katılaşması beklenir.

Nutrient Broth: 

Bakterilerin gelişimi için kullanılan genel sıvı besi yeridir.
Bileşimi:1) Et ekstraktı……………………………………1 g
Maya ekstraktı………………………………..2 gr pH= 7.4 ±0.2
Pepton…………………………………………5 g
Tuz (NaCl)……………………………………5 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Bileşimi:2) Et ekstraktı……………………………………10 g
Pepton…………………………………………10 gr pH 7.5±0.2
Tuz (NaCl)……………………………………5 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Bileşimi:3) Et ekstraktı……………………………………3 g
Pepton……….………………………………..5 g pH= 6.8 ±0.2
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Bileşimi:4) Et ekstraktı……………………………………3 g
Pepton…………………………………………5 g pH= 7.3±0.2
Tuz (NaCl)…………………………………… 8g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Hazırlanışı: Bileşenleri tartılır ve 1 L saf suda çözündürülür. pH’ı ayarlanır. Test tüplerine 10–15 ml kadar dağıtılır. Tüpler otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir.

Mac Conkey Agar: 

Koliform grubu bakterileri ile Salmonella ve Shigella bakterilerinin ayrım ve tanımlanmasında kullanılan selektif besi yeridir.
Bileşimi: Pepton……………………………………….20g
Laktoz…………………………………………10 g
Tuz (NaCl)……………………………………5 g pH= 7.1 ±0.2
Bile Salts No.3……………………………….1.5 g
Nötral kırmızısı………………………………0.03 g
Kristal viyole………………………………….0.001 g
Agar………………………………………….13.5 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Hazırlanışı: Besi yeri bileşenleri tartılır ve 1 L soğuk saf suda çözündürülür. Agar eriyene kadar karıştırılarak kaynar su banyosunda tutulur. pH’sı ayarlanır. Tüplere 15 – 20 ml kadar paylaştırılıp otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir.

Nutrient Agar: 

Agar katılmış Nutrient Broth besi yeridir.
Bileşimi:1. Et ekstraktı……………………………………1 g
Maya ekstraktı………………………………..2 g pH=7.4 ±0.2
Pepton…………………………………………5 g
Tuz (NaCl)……………………………………5 g
Agar………………………………………….15 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Bileşimi:2. Et ekstraktı……………………………………10 g
Pepton…………………………………………10 g pH 7.5±0.2
Tuz (NaCl)……………………………………5 g
Agar…………………………………………..15 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Bileşimi:3. Et ekstraktı……………………………………3 g
Pepton……….………………………………..5 g pH 6.8 ±0.2
Agar…………………………………………..15 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Bileşimi:4. Et ekstraktı……………………………………3 g
Pepton…………………………………………5 g pH 7.3±0.2
Tuz (NaCl)…………………………………… 8g
Agar…………………………………………..15 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Hazırlanışı: Bileşenleri tartılır ve 1 L saf suda çözündürülür. Agar eriyene kadar kaynar su banyosunda tutulur pH’sı ayarlanır. Otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir.

Brillant Green Bile Broth: 

Koliform grubu bakterilerinin tanımlanması, doğrulanması, izole edilmesi ve sayılmasında kullanılan selektif besi yeridir.
Bileşimi: Pepton………….………………………………10 g
Laktoz………………………………………….10 g pH= 5.6±0.2
Ox-bile(safra tuzları)……………………………20 g
Brillant gren veya %1’lik Brillant gren sulu
çözeltisinden 13.3 ml)…………………………0.0133 g
Saf su………………………………………… 1000cc(L)
Hazırlanışı: Hazır besi yerinden 40 g tartılır. Üzerine 1L saf su eklenip kuvvetlice karıştırılır. Besi yeri hazır değilse pepton ve laktoz 500 ml saf suda çözündürülür. Daha sonra 200 ml saf suda ox-bile çözündürülür. İki çözelti birbirine karıştırılır ve %1’lik Brillant green çözeltisinden 13.3 ml eklenir. Hacim saf su ile litreye tamamlanır pH’sı ayarlanır. Hazırlanan besi yeri, içine ters olarak Durham tüpleri yerleştirilmiş test tüplerine
10’ar ml dağıtılıp, otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir.

Violet Red Bile Agar: 

Koliform grubu bakterilerinin tanımlanması ve sayılmasında kullanılan selektif besi yeridir.
Bileşimi: Maya ekstraktı…………………………………3 g
Pepton………………………………………..7 g
Laktoz…………………………………………10 g
Tuz (NaCl)……………………………………5 g pH=7.4 ±0.2
Bile Salts No.3……………………………….1.5 g
Nötral kırmızısı………………………………0.03 g
Kristal viyole..……………………………….0.002 g
Agar………………………………………….15 g
Saf su………………………………………..1000cc(L)
Hazırlanışı: Hazır karışımdan 41.5 gr tartılır ve 1L saf su eklenip, agar eriyene kadar kaynar su banyosunda tutulur.Su banyosunda kaynama sıcaklığında en çok 5 dakika tutulur. pH’sı ayarlanır. VRBA otoklavda sterilize edilmez. Çünkü VRBA besi yeri ekim yapıldıktan sonra 35–37 ºC’ta 20–24 saat inkübasyon uygulanır. Besi yerinin su banyosunda kaynatılması sırasında ölmeyen mikroorganizmalar olsa bile bu kısa inkübasyon süresinde gelişemezler.

Baird-Parker Agar: 

Gıdalardaki stafilokok bakterilerinin tanımlanma ve sayımlarında kullanılan selektif besi yeridir.
Bileşimi: Triptofan…………………………………..10g
Et ekstraktı………………………………….5 g
Maya ekstraktı………………………………5 g pH=7.0 ±0.2
Sodyum piruvat…………………………… 10 g
Glisin……………………………………….12 g
Lityum klorür………………………………..5 g
Agar…………………………………… ……20 g
Saf su……………………………………….950 ml
Hazırlanışı: Hazır karışımdan 63 g tartılır ve 950 ml saf su ile çözündürülür. Agar eriyene kadar kaynar su banyosunda tutulur. pH’sı ayarlanır. Tüpler otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir. Otoklavlamadan sonra besi yeri sıcaklığı 40-450C’ye düşürülüp aseptik koşullarda 50 ml egg yolk- tellurit emülsiyonu eklenerek kuvvetlice karıştırılır.

Plate Count Agar: 

Gıdalarda, su,süt ve ürünlerinde canlı bakteri sayımlarında kullanılır.
Bileşimi: Tripton…..……………………………………5 g
Maya ekstraktı………………………………..2.5 g pH= 7.0 ±0.2
Glikoz.…………………………………………1 g
Agar……………………………………………15
Saf su………………………………………..1000cc(lt)
Hazırlanışı: Besi yeri bileşenleri tartılır ve 1L saf suda çözündürülür. Agar eriyene kadar kaynar su banyosunda tutulur. pH’sı ayarlanır ve gerekirse erlen, tüp vb dağıtılarak otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir.

Simmons Sitrat Agar: 

Enterobacteriaceae familyası bakterilerinin ayrımları için kullanılan besi yeridir.
Bileşimi: Magnezyum sülfat ……………………………0.2 g
Amonyum di hidrojen fosfat………………….0.2 g
Tuz (NaCl)……………………………………5 g pH=7.1 ±0.2
Sodyum amonyum fosfat……………………. 0.8 g
Tribazik sodyum sitrat…………………………2 g
Brom timol mavisi……………………………..0.08 g
Agar…………………………………………..15 g
Saf su…………………………………………1000cc(L)
Hazırlanışı: Hazır karışımdan 23 g tartılır ve 1L saf su ile çözündürülür. Agar eriyene kadar kaynar su banyosunda tutulur. pH’sı ayarlanır. Test tüplerine 10 – 15 ml kadar dağıtılır. Tüpler otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir. Otoklavlamadan sonra tüpler yatık olarak katılaştırılır.

Laktoz Broth: 

Gıdalarda, su, süt ve ürünlerinde koliform grubu bakterilerinin varlığının saptanması ve doğrulanması amacıyla kullanılan selektif besi yeridir.
Bileşimi:3 Et ekstraktı……………………………………3 g
Pepton……….………………………………..5 g pH=6.7-7.1
Laktoz…………………………………………5 g
Saf su………………………………………..1000cc(lt)
Hazırlanışı: Besi yeri bileşenleri tartılır ve 1 L saf suda çözündürülür. pH’sı ayarlanır. Hazırlanan besi yeri içine ters olarak Durham tüpleri yerleştirilmiş test tüplerine 10’ar ml dağıtılıp otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir.Eosin Metilen Blue Agar: 

Enterobacteriaceae familyası Gram (-) bakterilerinin ayrımı ve izolasyonu için kullanılır.
Bileşimi: Pepton…………………………………….10 g
Laktoz…..…………………………………5g
Sakkaroz…………………………………..5 g
Di potasyum hidrojen fosfat………………2 g pH= 7.2±0.2
Eosin Y……………………………………0.4
Metilen mavisi……………………………0.065 g
Agar……………………………………….13.5 g
Saf su…………………………………… ..1000cc(L)
Hazırlanışı: Hazır karışımdan 36 gr tartılır ve 1 lt saf su eklenip, agar eriyene kadar kaynar su banyosunda tutulur. pH’ı ayarlanır. Otoklavda 121 ºC’ta 15 dakika sterilize edilir. Besi yeri 60 ºC’lara düşürülür. Sterilizasyon sırasında ısı etkisiyle metilen mavisi indirgendiğinden besi yeri turuncu renge dönüşür. Metilen mavisinin okside olup kendi mavi-mor renge dönmesi için besi yeri çalkalanıp, aseptik koşullarda, steril petri kutularına 15 – 20 ml kadar boşaltılır.