ELEKTROFOREZ

Karışımda bulunan maddelerin tümü veya bazıları iyonlaşabiliyorsa, karışım bir elektrik alana konmak suretiyle bir dereceye kadar ayrılabilir. Bilindiği gibi bir elektrik alanda iyonlar hareket ederler. Bu hareketin hızı iyonun cinsine, yüküne, alanın şiddetine bağlıdır. Bu metot “elektroforez” olarak nitelendirilir ki elektrolizin tamamlanmamış şeklidir. Çünkü elektroforezde maddeler elektrolizde olduğu gibi, kendilerini çeken elektroda kadar gidemeyip yolları üzerindeki bir noktada durdurulmaktadır.

İyonik bileşiklerin iyonlaşması, elektroforezin temelini oluşturur. Zıt yükteki elektrodlara doğru, farklı hızlarda hareket eden değişik yükteki iyonlar elektriksel alanda birbirinden ayrılırlar. Yüksüz, kovalans moleküller elektriksel alandan etkilenmezler, elektroforetik hareket göstermezler.

Elektroforezde Etki Eden Faktörler

İncelenen örneğin özelliği (yükü, boyutu, şekli)

Elektrik alanının etkisi (voltaj, akım, direnç)

Tamponunun etkisi (bileşim, konsantrasyon, pH)

Destek ortamın etkisi (Adsorbsiyon, elektro-osmoz, moleküler ayırma)

Genel Teknikler

Alet ve ekipmanlar

Genel olarak gerekli ekipmanlar güç ve elektroforez ünitesinden oluşmaktadır. Güç ünitesi sabit doğru akım sağlamalı voltaj ve akım çıkışının her ikisinide kontrol edebilmelidir. Düşük voltaj elektroforezi için ya sabit voltaj yada sabit akım sağlayabilen 0-500 V ve 0-150 mA çıkışa sahip güç üniteleri kullanılabilir.

Elektroforez ünitesi elektrotları, tampon rezervuarlarını, elektroforez ortamı için bir destek ve şaffaf güvenlik kapağını içerir. Elektrotlar paslanmaz çelikten olabilir. Ancak bunlar bazı tamponlar tarafından korozyona uğratıldıklarından platin elektrotlar tercih edilmektedir.

Destek ortamının seçimi:

Molekülleri boyutlarına göre de ayırabildiğinde daha iyi bir elektroforetik ayrım sağlar.

Kağıt, selüloz asetat, ince tabaka ortamı,blok ortamı, jeller (nişasta, agar jeli, poliakrilamid jeli)  kullanılan destek ortamlarıdır.

En çok kullanılan ortam olan jellerden kısaca bahsedersek:

Nişasta jeli: kısmi hidrolize olmuş nişasta karışımının uygun bir tampon içerisinde ısıtılması ve ardından soğutulması ile hazırlanır. Bu işlem nişastanın amilopektin bileşeninin dallanmış zincirinin birbirine bağlanmasına ve yarı sert bir jel oluşturmasına neden olur. Jeller kullanılmadan önce 0-4 °C’de saklanırlar.

Agar Jeli:Agar ucuz toksik olmayan abcak kimyasal olarak iyi tanımlanmamış toz karışımı agaroz ve amilopektin olmak üzere iki galaktoz esaslı polimerdir.Agaroz 38 C dejel oluşturur. Tamponda %1 (w/v) agar bulunması durumunda iyi bir fiber yapı büyük gözenek boyutları ve düşük sürtünme kuvveti gösterir. Sonuçta elektroforez sırasında iyonların çok hızlı hareket etmesini sağlarlar. Bu yüzden makro moleküllerin ayrımını kolaylaştırmaktadırlar.

…

ELEKTROFOREZ NEDİR?

 – Elektroforez genel anlamda, özel bir sıvı ortamda, parçacıkların içerdikleri elektriksel yüke göre farklı hızda ve farklı yönde hareket etmesi sonucu, bütün bir maddenin yapısındaki farklı maddelerin ayırt edilebilmesini sağlayan bir inceleme yöntemidir.

 – İlk kez 1937 yılında Arne tiselius tarafından geliştirilmiş olan elektroforezden, özellikle tıpta ve biyokimyada, kandaki çeşitli protein ve lipitlerin ayrılması, tanınması ve miktarının ölçülmesinde yararlanılır. Ayrıca elektroforezden sanayide yaygın biçimde yararlanılmaktadır.

ÇALIŞMA PRENSİBİ

– Elektroforezin çalışma ilkesi; molekül ağırlığı ve molekülde bulunan elektrik enerjisinin jel içinden bir yükten diğerine giderken kat ettiği mesafe farklılıklarını ele almaktır. Bu farklılıklara göre enzim ya da proteinin birbirinden farkı anlaşabilir.

– Anyonlar anoda, katyonlar katoda hareket ederler. Moleküllerin elektroforezdeki hızını etkileyen çeşitli faktörlerde vardır.

Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır:

-İyonların hareket edebileceği uygun bir destek ortamı (kağıt,selüloz asetat,nişasta,agaroz jeli ya da poliakrilamit)

-Elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı

-Uygun pH’da bir tampon çözelti

-Birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometre.

GÜÇ KAYNAĞI

– Elektrotlar arasında elektrik akımı sağlar.

– Göç hızının artması,

– Ayırt edilen moleküllerin buharlaşması,

– Su kaybı,

– İyon konsantrasyonunun artması,

– Tampon viskozitesinde azalma  direncinin düşmesi,

– Bu problemleri en aza indirmek için: sabit akımlı güç kaynağı kullanılmalıdır.

Tamponlar

– Elektrik akımını taşımak

– Elektroforezin yürütüldüğu pH’yı belirlemek

– Yürütülen molekülun elektriksel yükünü belirlemek

 Tamponun iyonik gücü ise ;

– İyonik bulutun kalınlaşması

– Migrasyon oranı

– Elektroforetik zonların daha keskin ayrılması

– Moleküllerin hareket etmesinde önemlidir.

– Barbital tamponlar & Tris-borik asid-

– EDTA tamponları en iyi bilinen tamponlardır.

BOYAMA

 – Elektroforez tamamlandıktan sonra destek ortamı bir boya ile muamele edilerek ayrılmış fraksiyonların  identifikasyonu sağlanır.

 -Numune tarafından alınan

boyanın miktarı ;

 – proteinin tipine

 – sabitleyici ajanların oluşturduğu

denatürasyon derecesine bağlıdır.

  En iyi bilinen boyalar ;

 Elektroforetik Mobilite (U)

Alana uygulanan güç başına göç hızıdır.

iki denklemden türetilmistir;

1 .Elektrik alanın iyon üzerine oluşturduğu hareket gücü

Fe = qE : q net yuk, E ise elektrik alan gücü

2. Buna zıt olarak destek ortamın sürtünme direnci sonucu olusan hareketi engelleyici güçtür

Fs = fv : f sürtünme gücü , v hız

3. qE = fv

4. Sonuç olarak, Elektroforetik mobilite (U) = v/E = q/f = q/6pηr :

η destek ortamın viskozitesi, r molekülün çapı

Bu formüle göre, elektroforetik mobilite net yük ile doğru ; molekül büyüklüğü ve elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır.

Elektroforezde Göç Hızı

– Molekülün net elektriksel yüküne

– Molekülün yapısı ve büyüklüğüne

– Elektriksel alanın gücüne

– Destek ortamın özelliğine

– Uygulama ısısına bağlıdır

oElektroforezin genel prosedürü

a.Uygulama

b.Yürütme

c.Boyama

d.Temizleme

1. Şeffaflaştırma

2. Değerlendirme

   Uygulama ve yürütme:

Tekniğe,süreye ve analizin çeşidine göre değişebilir.

   Boyama:

Sadece incelenecek maddeyi boyayan boyalar kullanılır.

  Temizleme:

Normalde destek ortamı boya içine konduğunda tamamen boyanır.Ancak biz sadece incelenecek kısmın boyalı kalmasını isteriz. Bu nedenle de destek ortamı belli bir temizleme sıvısında bir süre tutulur. (% 5 asetik asit)

  Şeffaflaştırma:

Dansitometre de okuma yapılabilmesi için destek ortamının şeffaf olması gerekir.Bunun için %30-40 dimetil sülfoksit veya diğer şeffaflaştırıcılar kullanılabilir.

  Değerlendirme:

Dansitometre de yapılır.

Elektroforez çeşitleri

–        Kâğıt elektroforezi

–         Selüloz asetat elektroforezi

–         Jel elektroforezi

–      a)Agaroz jel elektroforezi

–      b)Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE)

–         SDS-poliakrilamid jel elektroforezi

–         Kapiller elektroforez

–         İmmünoelektroforez

–         Nişasta jeli elektroforezi

Kağıt elektroforezi

– Hem rutin hem de araştırma maksatlı olarak kullanılabilir. Destek ortamı olarak kaliteli filtre kağıdı kullanılır. Metodun avantajı, ucuz ve yüksek gerilime dayanabilmesidir. Ancak deney süresi uzun olduğundan rutinde pek kullanılmaz. Özellikle aminoasitlerin ayrımında kullanılır.

Selüloz asetat elektroforezi

     Selülozun hidroksil grupları, asetik anhidrit ile reaksiyona    sokulursa selüloz asetat elde edilir.

  Avantajları:

     Hem elektroforez süresi kısa (30-0 dk) hemde  deney bittikten sonra numuneleri uzun süre korumak mümkün olduğundan rutinde sık kullanılır.

 Dezavantajları:

     Rezolüsyon jeldeki kadar iyi değildir. En önemli dezavantajı da

     standardizasyonu iyi değildir. Aynı firmaca üretilen aynı parti

     içinde bile farklılıklar görülebilir.

Agaroz jel elektroforezi

– Destek maddesi olarak bir karbonhidrat polimeri olan agaroz veya agaropektin kullanılır. Bu maddelerin proteinlere affinitesi az olduğundan protein bantları birbirinden daha iyi ayrılır. Ayrıca çok iyi şeffaflaştıkları için dansitometrik değerlendirmeleri daha güvenilirdir. Bu nedenle rutin uygulamalarda sıkça kullanılmaktadır. Deney süreside oldukça kısadır (30-90 dk.)

– Serum proteinleri, nükleik asitler, hemoglobin varyantları, laktat dehidrogenaz ve kreatin kinaz izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonları ve diğer bazı maddelerin analizlerinde başarı ile kullanılmaktadır.

Nişasta jeli elektroforezi

– Destek materyali olarak nişasta kullanılır.

-Nişasta jel elektroforezi hem yüzey yükü, hem de molekül büyüklüğüne bağlı olarak ayırt edilen makromoleküler iyonların özelliklerinin anlaşılmasına izin verir. Doğal nişasta jelleşmediğinden kısmen hidrolize olarak kullanılır.

– Agaroz jelde olduğu gibi, nişasta jelde de işlem horizontal olarak gerçekleştirilebilir.

Poliakrilamid jeli elektroforezi

-Poliakrilamid jel elektroforezinde 20 yada daha fazla fraksiyon elde edilir.

-Bu nedenle genetik varyantlar ve izoenzim analizleri olmak üzere, protein ve nükleik asit çalışmalarında tercih edilir.

-Separasyon; moleküllerin büyüklüğüne ve yüküne bağlıdır.

-Ayrılan protein zonlarının diskoid şeklinden dolayı bu metod bazen disk elektroforezi olarak da tanımlanmaktadır

   Avantajları:

-Termostabil, saydam, kimyasal olarak inerttir.

– Geniş por büyüklüğüne sahiptir.

-Yüksüzdür.

-Dezavantajı:

 Kanserojeniktir.

SDS-poliakrilamid jel elektroforezi

 – Bu elektroforez tipinde β-mercaptoethanol kullanılır amaç disulfid köprülerini indirgemektir.

 – β-mercaptoethanol & SDS, numune ile 5 dakika kaynatılır.

 – SDS: Kuvvetli deterjan etki ile  proteinleri denatüre eder. SDS proteinlerin yüzeyini kaplar ve proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanır .

– Separasyon moleküler büyüklüğe göre gerçekleşir.

– Genellikle proteinlerin molekül ağırlığı ve proteinlerin saflık tayininde kullanılır.
Kapiller elektroforez

– Sistem ters cevrilmis ‘U’ seklinde duran ve ucları tampon dolu tuplere batmıs durumda iken yüksek gerilim uygulanan bir borudan oluşur.

– Dış yüzeyi; ya bir sıvı kılıfı yada soğuk hava akımı ile soğutularak ısınma sorunu ortadan tamamen kalkar.

– Çok kırılgan olan bu kapillerin kırılmasını önlemek icin üzeri poliimid tabakası ile kaplanmıstır.

– Poliimid tabakasının detektor önune gelen kısmı ya soyularak yada yakılarak bir pencere açılır.

– Bu pencere, spektrofotometre kuveti görevi görür.

– Elektroforezle ayrılan moleküller bu pencereden geçerken ısığı absorbe ederler.

– Absorbe edilen ışık detektör tarafından saptanır.

– Bilgisayar sistemi aracılığı ile absorbsiyon pikleri ekrana verilir .

İmmünoelektroforez

–   İlk kez 1953 yılında Grabar ve Williams isimli iki bilim adamı, jel elektroforezi sonrası immün diffüzyon uygulamışlardır.

-İmmünelektroforez ile bir çok spesifik protein gösterilebilir:

-Prealbumin, albumin, α1- asit glukoprotein, α1-antitripsin, tiroid bağlayan globulin, α1-kimotripsin, α2-HS glukoprotein, α2-makroglobulin, seruloplazmin, haptoglobin, antitrombin III, C1 esteraz inhibitörü, hemopeksin, β lipoprotein, transferrin, C3, C4, C5, properdin faktör B, plazminojen, IgA, IgM, IgG.

–   Bu yöntem bu gün klinik laboratuarlarda, immünglobulinlerin gösterilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır.

-İmmunelektroforez için agaroz jel kullanılır.

-Bu yöntemin prensibi; serum proteinlerinin elektroforetik ayrımından sonra, aranan proteine karşı antiserum ekleyerek antijen-antikor presipitatlarının gösterilmesidir.

Diğer elektroforez yöntemleri

– iki yönlü Jel Elektroforez

– İzoelektrik Odaklanma

– O’Farrell Metodu

– Pulse Field Jel Elektroforez (PFGE)

– Preparative Gel electroforezi

– Protein Elektroforezi

– Serum Protein Elektroforez

– Hemoglobin Elektroforezi

– Lipoprotein Elektroforezi

Kullanım yerleri

• Saflaştırma

• Saflık kontrolü

• Molekül ağırlığı saptama

• Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalıkların belirlenmesi

• Enzim izozimlerinin saptanması (tanısal amaçlı, populasyon çalışması için,adli tıpta)

• İmmünolojik ve moleküler biyoloji

…