Toksisite Testleri ( Prof.Dr.Gönül ŞAHİN )

TOKSİSİTE TESTLERİ

•Prof.Dr.Gönül ŞAHİN

•Kimyasal Maddenin Toksisitesinin Saptanması

•Her kimyasal madde uygun yolla ve uygun dozda canlı organizmaya verildiğinde zararlı etki meydana getirme kapasitesine sahiptir.

•Kimyasal maddenin bir etki meydana getirebilmesi için öncelikle belirli bir yoldan vücuda alınması, absorbe olması gereklidir.

•SONUÇTA meydana gelen etkinin şiddeti, organizmada etki yerine ulaşan madde miktarına bağlıdır.

•Bir kimyasal maddenin toksisite riskini belirlerken sadece ne tip bir etkisi olduğunu bilmek yeterli değildir.

Etkiyi yaratacak doz düzeyi, maddenin fizikokimyasal özellikleri, temas koşulları ve temas edilen organizma/ birey hakkında bilgi sahibi olmak gereklidir.

Toksisiteyi etkileyen esas faktörler toksik maddenin dozu, veriliş yolu, temas süresi ve sıklığıdır.

•Toksik ajanların vücuda ana giriş yolları mide-barsak kanalı, akciğerler (inhalasyon), deri (topikal, perkütan, veya dermal) ve diğer paranteral yollardır.

  Toksik ajanlar genel olarak en hızlı etkiyi ve en hızlı cevabı intravenöz yol ile doğrudan vücuda alındıklarında meydana getirirler.

  Diğer giriş yolları için sıralama şu şekildedir:

  iv > inhalasyon > ip > sc > im > id > oral > dermal

  Oral, inhalasyon ve topikal temasta maddenin toksisitesine taşıyıcı ve formülasyon faktörleri de etki eder.

•Vücuda giriş yolu da maddenin toksisitesini değiştirebilir.

Bir maddeye farklı yollarla temas sonucunda elde edilen LD50 değerlerinin karşılaştırılmasıyla o maddenin absorpsiyonu hakkında yararlı bilgiler elde edilebilir.

Oral veya dermal uygulama sonrasındaki LD50 değerinin, iv uygulama sonrasında elde edilen LD50 değerine benzer olması, toksik ajanın hızlı ve kolay absorbe olduğunu gösterir.

•Dermal yol ile uygulanan bir maddenin LD50 değeri, oral yol ile uygulandığında elde edilen LD50değerinden birkaç kat yüksek ise (LD50 dermal > LD50 oral) cildin bu ajan ile zehirlenmelerde iyi bir bariyer olduğu söylenebilir.

Herhangi bir temas yolu ile meydana gelen toksik etki, ajanın taşıyıcıdaki konsantrasyonu, taşıyıcının toplam hacmi, biyolojik sistemin maruz kaldığı taşıyıcının özellikleri tarafından da etkilenir.

•Maruziyetten uzun zaman sonra kandaki kimyasal madde konsantrasyonunun belirlendiği çalışmalarda bu ve diğer faktörlerin rolü de değerlendirilmelidir.

Deneylerde bu koşulları sabit tutmak ve standardize etmek gerekir.

•Kimyasal maddelere temas süresi ve sıklığı

Deney hayvanlarının kimyasal maddelere

teması genel olarak 4 şekilde gerçekleştirilir:

1- Akut temas……….. Akut toksik etkiler

2- Subakut temas………. Subakut toksik etkiler  

3- Subkronik temas……… Subkronik toksik etkiler

4- Kronik temas…………. Kronik toksik etkiler

•AKUT TEMAS: Bir kimyasal maddeye 24 saatten daha kısa sürede herhangi bir yolla tek bir temas akut temas olarak tanımlanır. Toksisitesi düşük veya pratik olarak non-toksik maddeler için 24 saatte tekrarlanan temas da akut temas sayılır.

SUBAKUT TEMAS: Kimyasal maddeye 1 ay veya daha kısa sürede tekrarlanan şekilde temas subakut temas olarak tanımlanır. Yönetmeliklere göre 14 veya 28 günlük temas testleri ile uygulanır.

SUBKRONİK TEMAS: Kimyasal maddeye 1-3 ay süreli tekrarlanan temastır. Yönetmeliklere göre 90 günlük testler kullanılarak çalışılır.

KRONİK TEMAS: 3 aydan uzun süreli, tekrarlanan temastır.

•İnsanda ise temas sıklığı ve süresi genel olarak kontrollü hayvan çalışmalarında olduğu gibi açıkça tanımlanmamıştır.

•Ancak genel temas durumunu belirlemek için benzer terimler kullanılmaktadır.

•Çalışma yeri ve çevresel temaslar süreye göre AKUT (tek bir temas), SUBKRONİK (birkaç hafta veya ay boyunca meydana gelen temas), KRONİK (birkaç ay veya yıl boyunca meydana gelen temas) olarak tanımlanabilir.

•* Çoğu maddenin tek temas etkisiyle tekrarlanan temas sonucunda gösterdiği etkileri farklıdır.

Örneğin: Benzen

Primer akut toksik etki: SSS depresyonu

Tekrarlanan temas: Hematopoetik sistemi etkiler, lösemi riskinde artışa neden olur

* Hızla absorbe olan maddelere akut temas ani toksik etkiler oluştururken, bazı maddelere akut temas gecikmiş etkiler oluşturur.

•* Toksik bir ajana kronik maruziyet, maddenin kronik etkilerinin yanı sıra bazı ani (akut) etkiler de oluşturabilir.  

Bir kimyasal ajanın toksisitesinin belirlenmesinde

sadece tek doz (akut) ve uzun süreli (kronik) etkileri ile ilgili değil, aynı zamanda akut temas süresi hakkında da bilgiye ihtiyaç vardır. 

•Ajanın toksisitesini etkileyen bir diğer faktör de temas sıklığıdır.

Genel olarak dozun bölünerek verilmesi, terapötik veya toksik etkiyi azaltır.

SONUÇ:

Tekrarlayan temasla gelişen toksisiteyi etkileyen faktörler temas süresi ve sıklığıdır.

Kimyasal madde

  biyolojik sistemde birikiyorsa,

  irreversıbl toksik etki oluşturuyorsa,

  temas aralığı içinde sistemin iyileşmesi için yeterli zaman yoksa

kronik toksik etkiler meydana gelir

•TOKSİSİTE TESTLERİNİN AMACI

Kimyasal maddenin

•biyolojik sistemlerde meydana getirdiği zararlı etkileri saptamak,

•doz-cevap ilişkisini belirlemek,

•toksisite meydana getirdiği koşulları belirlemek

Meydana gelen toksik etkinin

•doğasını

•niteliğini

•niceliğini tanımlamaktır

•Bu koşulları ve oluşan etkinin doğasını tanımlamak için çeşitli toksisite testleri yapılır.

Toksisite testleri arasındaki temel farklılık,

doz ve kimyasal maddeye maruz kalma süresidir

Toksikolojide doz ve cevap önemlidir. Kimyasal maddeye organizmanın verdiği her cevap önemli olup, incelenmelidir. Toksik cevap ölçülebilen kaba bir parametre olabildiği gibi ölüm ile de sonuçlanabilen bir etki de olabilir

•Bir patolojik lezyon, biyokimyasal, kimyasal, farmakolojik cevap ve değişim toksik cevabın göstergesi olabilir

Letal dozu bilmek ise her zaman önemli/ gerekli olmayabilir. Ancak toksisitenin hangi dozda oluşabileceğinin bilinmesi önemlidir.

Buna rağmen insandaki toksik dozu her zaman saptamak kolay değildir. Eldeki verilerden insana uyarlama yapmak zordur.

•Toksisite testlerinin ortak özellikleri

Bütün testler

•sağlıklı,

•uygun koşullarda muhafaza edilmiş,

•derecelendirilmiş dozlara maruz bırakılan hayvanlara uygulanır

Bütün testlerde

•kontrol grubu kullanılır

Uygulamayı takiben

•toksisite işaretleri gözlenir

•ayrıntılı olarak kaydedilir

•testi takiben kontrol grubu dahil tüm hayvanlara patolojik testler uygulanır

•TOKSİSİTE TESTLERİ

1- GENEL TOKSİSİTE TESTLERİ

•Akut toksisite testleri

•Subakut toksisite testleri

•Subkronik toksisite testleri

•Kronik toksisite testleri

2- ÖZEL TOKSİSİTE TESTLERİ

•Teratojenite

•Karsinojenite

•Mutajenite

•Göz ve ciltte lokal etki

•Üreme fonksiyonlarının incelendiği testler

•Davranışsal toksisite testleri vd

•AKUT TOKSİSİTE TESTLERİ

Oral, topikal, inhalasyon veya injeksiyon yoluyla 24 saat içerisinde tekrarlanan dozlarla veya kısa bir süre içinde tek bir dozla ortaya çıkan toksisiteyi tanımlar

•BİYOLOJİK ÖNEMİ OLAN HER MADDEYE MUTLAKA UYGULANAN TEK TESTTİR.

•Bir maddenin toksik özelliklerinin değerlendirilmesinde LD50 tayini yoluyla akut toksisitenin ölçülmesi ilk basamağı oluşturur.

•AKUT TOKSİSİTE TESTİ

Maddenin doz-cevap ilişkisini ve LD50 değerinin saptamasını sağlar

Hedef organların belirlenmesine ve akut toksisitenin diğer klinik göstergelerinin saptanmasına yardımcı olur

Toksik cevabın geri dönüşümlü olup olmadığı hakkında bilgi verir

•LD50 ve LC 50 değerleri sınırlı öneme sahip olmalarına rağmen, akut toksisite çalışmaları kimyasal maddelerin toksik etkilerinin tanımlanmasında ve bu maddelerin insandaki tehlikesinin belirlenmesinde esansiyel öneme sahiptir.

•Akut toksisite testlerinden elde edilen en anlamlı bilimsel veriler saptanan LD50 değerinden çok,  klinik gözlemler ve ölüm sonrası yapılan incelemelerden elde edilir.

•LD50 (Medyan letal doz)

•Solunum yolu dışında diğer bir yol ile organizmaya girerek etki gösteren katı veya sıvı haldeki kimyasal maddenin belli koşullarda bir defada verildiğinde, verildiği gruptaki hayvanların %50’sini öldüren dozdur. Birimi mg/kg’dır.

•LD50 (Medyan letal doz)

•LC50 (Medyan letal konsantrasyon)

Solunum yolu ile organizmaya girerek etki gösteren gaz halindeki kimyasal bileşiklerin akut toksisite ölçüsüdür.

Belirli koşullarda solunum yolu ile bir gruptaki hayvanların % 50’sini öldüren kimyasal maddenin solunan havadaki konsantrasyonu olup, birimi ppm veya mg/m3’tür

•AKUT ORAL TOKSİSİTE TESTİNİN İLKESİ

•Test maddesi artan dozlarda farklı hayvan gruplarına gavaj ile verilir.

•Aralık saptama testi (sınır testi) ile hangi doz aralığında çalışılacağı saptanır.

•Mortalite ve gözlenen etkiler kaydedilir

•Test sırasında ölen hayvanlara nekropsi uygulanır

•Süre sonunda yaşayan hayvanlar da öldürülür ve nekropsi uygulanır

•Eğer maddenin ağrı ve belirgin bir rahatsızlık yapma özelliği varsa bu test yapılmamalıdır.

•Aralık saptama testi

Kemirici hayvan ile deney yapılıyorsa, öncelikle 5 erkek, 5 dişi hayvan kullanılarak 2 g/kg’lık tek bir doz düzeyi ile aralık saptama testi yapılır. Eğer ölüm gözlenmezse maddenin akut toksisitesini belirlemeye gerek yoktur.

Bu testlerle uygun doz aralığı belirlendiğinden detaylı testlere geçilebilir

•AKUT TOKSİSİTE TESTLERİ

•Tür: Memeli (tercihan sıçan)

•Doz düzeyi: En az 3

•Sayı ve seks: En az 5, aynı seksten

•Gözlem süresi: En az 14 gün

  (Süre kimyasal maddenin toksisitesi ve karakteristik özelliğine bağlı olarak seçilir: 14 veya 28 gün)

•Hayvanlar hergün izlenir

•LD50 tayini
deney hayvanlarını gruplamak,
kimyasal maddeyi artan dozlarda vermek
sonuçta ölen hayvan yüzdelerini hesaplamak
sonuçları istatistiksel olarak değerlendirmek suretiyle yapılır

•Striknin sülfat için LD50: 2 mg/kg (sıçan, i.p.)

  Striknin sülfat için LD50 değeri, intraperitonal uygulamayı takiben 2 mg/kg’dır

•Gözlem süresi sonunda ölen toplam hayvan sayısı saptanır

•Hayvanların % 50’sinde ölüme neden olan dozu hesaplamak üzere veriler istatistiksel olarak değerlendirilir

Bu amaçla değişik yöntemler kullanılır

•Traven yöntemi

•Karber-Behrens yöntemi

•Probit analiz yöntemi


Grafik Yöntemleri
I-

•Normal bir grafik kağıdına dozlar x eksenine, bu dozlara karşılık gelen ölüm yüzdeleri de y eksenine geçirilerek bir grafik çizildiğinde karakteristik bir sigmoid eğri elde edilir.

•% 50 ölüm oranına karşılık gelen doz, x eksenine indirilen dikey çizgiden bulunur.

•Grafik yöntemleri
II-

•Diğer bir yöntemde ise x eksenine log doz, y eksenine ölüm yüzdesi işaretlenir. Yine sigmoid bir eğri elde edilir

•LD50 değeri yine % 50 ölüme karşılık gelen doz kullanılarak hesaplanır. Sadece antilog almak gereklidir.

•Probit Analiz Yöntemi

•En çok kullanılan yöntemler arasındadır. Bu yöntemin kullanılabilmesi için istatistiksel hesaplamalar sonucu düzenlenmiş Probit- analiz cetveli ile özel olarak hazırlanmış logaritmik-Probit grafik kağıdına gerek vardır.

•Logaritmik Probit kağıdında x eksenine dozlar, y eksenine % ölümlerin probit cetvelinden bulunan Probit karşılıkları işaretlenir.

•LD50 değeri, gözlenen toksik etkiler ve nekropsi bulguları ile birlikte değerlendirilmelidir.

LD50 sınıflama ve etiketlemede referans değer olarak kullanılır

•SUBAKUT TOKSİSİTE TESTLERİ
(TEKRARLANAN DOZ ÇALIŞMALARI)

•Subakut toksisite testleri bir kimyasal maddenin tekrarlanan temasla ortaya çıkan toksisitesini belirlemek amacıyla yapılır.

•Bu testler subkronik çalışmalar için dozun belirlenmesine yardımcı olan testlerdir.

•SUBAKUT TOKSİSİTE TESTLERİ

•14 günlük tekrarlanan doz toksisite testleridir.

•Tür: Memeli (tercihan sıçan)

•Doz düzeyi: En az 3 (Toksik doz, ara doz, toksik olmayan doz)

•Sayı ve seks: 10; 5 erkek, 5 dişi

•Gözlem süresi: 14 veya 28 gün

  (Süre kimyasal maddenin toksisitesi ve karakteristik özelliğine bağlı olarak seçilir: 14 veya 28 gün)

•Bu süre sonunda klinik kimyasal ve histopatolojik testler yapılır.

•SUBKRONİK ORAL TOKSİSİTE TESTLERİ
(90 GÜNLÜK TESTLER)

AMAÇ

1- Maddenin NEL-NOAEL değerleri (güvenlik kriterleri) hakkında bilgi edinebilmek

2- Sınırlı bir sürede, tekrarlanan temasın ardından test maddesinin etkilediği hedef organ veya dokuları belirlemek ve ortaya çıkabilecek riskler hakkında bilgi edinebilmek

3- Maddenin kümülasyon (birikme) olasılığı hakkında bilgi edinmek

4- Kronik çalışmalar için doz seçimi konusunda fikir elde etmektir

•Tür: Memeli (tercihan sıçan, bazen köpek)

•Doz düzeyi: En az 3 (Toksik doz, ara doz, toksik olmayan doz)

•Sayı: En az 20 (köpek için 8)

•Seks: 10 dişi, 10 erkek

•Gözlem süresi: 90 gün

    Günde 1 kez, haftada 1 tartım

•Deney öncesi ve sonrası yapılan işlemler:

•Klinik inceleme

•Oftalmolojik inceleme (deney öncesi ve sonrası)

•Hematolojik inceleme (deney sonrası)

•Klinik biyokimyasal inceleme (deney sonrası)

•Patolojik testler: Tüm hayvanlara gros nekroskopik testler uygulanır

•KRONİK TOKSİSİTE TESTLERİ

•Kimyasal maddeye uzun süreli, düşük dozda ve tekrarlanan temasla gelişen toksisiteyi belirlemek

•Kimyasal maddelerin gecikmiş ve kümülatif etkilerini saptamak amacıyla yapılan testlerdir

•Çalışma düzeni ve değerlendirme şekli değiştirilerek karsinojenik etki gibi latent bir süreyi takiben ortaya çıkan etkileri saptamak amacıyla da kullanılırlar.

•Kronik Toksisite testleri

•Tür: Sıçan (nadiren köpek, primat)

•Doz düzeyi: En az 3 (Toksik doz, ara doz, toksik olmayan doz)

•Sayı, Seks : 20 dişi, 20 erkek

       (köpek için 4 dişi, 4 erkek)

•Uygulama yolu: Oral (inhalasyon, dermal)

•Gözlem süresi: Hayvanın yaşam süresi

•Gözlem: Günde 1 kez, haftada 1 tartım

•KRONİK TOKSİSİTE TESTLERİ

•Hematolojik inceleme: 3. ayda/ 6. ayda/ 12. ayda

•Klinik biyokimyasal inceleme: En az 6 ayda 1 kez

•Patoloji: Tüm hayvanlarda deney sonrası gros nekroskopi ve histolojik inceleme yapılır. Bu incelemeye prematüre olarak ölen hayvanlar da dahildir.

•Özel Toksisite testleri

Genel toksisite testleri ile saptanamayan veya bu testlerde karşılaşılmış olmasına rağmen ayrıntılara inilemeyen bazı özel toksik etkileri saptamak amacıyla yapılan testlerdir

•Teratojenite

•Mutajenite testleri

•Davranışsal toksikoloji

•İmmünotoksikoloji

•Toksikolojide hayvan deneyi sonuçlarını etkileyen faktörler

1] Hayvana ait endojen faktörler

2] Hayvana ait endojen faktörlerle etkileşerek gözlenen yanıtı etkileyen eksojen faktörler

3] Doğrudan test maddesi ile etkileşen eksojen faktörler

•1] Hayvana ait endojen faktörler

•Hayvanın türü, suşu ve cinsiyeti

•Hayvanın sağlığı

•Hayvanın yaşı

2] Eksojen faktörler

•Çevresel faktörler (ışık, temp., nem, mevsimsel, günlük değişimler)

•Diyet, içme suyu, bakım, bakım koşulları, beslenme, diğer hayvanlara maruziyet

•Test maddesi dışındaki diğer maddelere temas

•Hayvanı tutuş şekli, işlem şekli, numune alma

3] Test maddesi ile etkileşen eksojen faktörler

•Doku örneklerinin elde edilmesi saklanması, işlenmesi

•Test maddesinin konsantrasyonu ve bileşimi üzerine ışık, sıcaklık ve nemin etkisi

•Kimyasal maddenin veriliş yolu

Facebook Yorumları

Bir Cevap Yazın