Deneyin Adı: Bacillus cereus izolasyonu

Deneyin Amacı: Maydanoz örneğinde Bacillus cereus aranması

Bacillus Cinsi Bakterilerin Genel Özellikleri

Bacillaceae familyasına dahil olup, gram(+) [bazı türleri değişken], aerobik veya fakültatif anaerobik, spor oluşturan, çubuk şeklinde katalaz (+) bakterilerdir. Çoğunlukla mezofilik olmakla birlikte psikrotrof ve termofilik türleri de vardır. Endospor oluştururlar. 100 °C ‘de 10 dakika kaynatma bakterinin vejetatif şekillerini öldürür fakat sporlar ölmeyebilir. Toprak kökenli olup, gerek toz ve toprak ile gerekse su ile yayılım göstermektedir. Beyaz-krem renkli, sarı, pembe, portakal rengi ve siyah renklerde pigmentli koloniler oluşturabilir. Şekeri fermente ederler ve asit üretirler. Ancak gaz oluşumu görülmez. Proteinleri ise, amonyak oluşumu altında parçalarlar ve böylece kokuşmaya neden olurlar. Bacillus türleri sporlarının görünümüne göre 3 grupta toplanmıştır. Birinci grup Bacillus türleri kendi içlerinde A ve B olmak üzere ikiye ayrılır. Her iki grupta sporangia (İçinde eşeysiz sporlar üretilen yapı)şişmemiştir. Sporlar elips veya silindirik şekilli, santral(hücre çekirdeği merkezde bulunan) veya terminal(hücre çekirdeği hücre uç noktasında bulunan) konumludur. A grubu ve B grubu arasındaki fark ise A alt grubunda hücre genişliği 1 µm’den küçük, B alt grubunda ise 1 µm’den büyüktür. İkinci grupta yer alan Bacillus türlerinde sporangia şişmiştir. Sporları elips, santral veya terminaldir. Üçüncü grupta yer alan Bacillus türlerinde de sporangia şişmiştir. Sporlar küresel, sub-terminal ve terminal konumludur.

Bacillus cereus ‘un Genel Özellikleri

Bacillus cereus, toprak ve bitki örtüsü üzerinde yaygın bir şekilde bulunmaktadır. Cereus adını tahıl anlamındaki cereal ‘den alır. 1.2 – 5.0 µm arasında hücre boyutuna sahiptir. Santral (hücre çekirdeği hücrenin ortasında bulunan) veya subterminal (hücre çekirdeği hücre ucuna yakın yerde bulunan) yapıda, hareketli ve aerobiktir. Üreyebildiği sıcaklıklar suşlara göre farklılık gösterir. Optimum 30 ^oC , maksimum 37 – 48 ^oC , minimum 10 – 18 ^oC arasındadır. Gelişebildiği pH aralığı 4.9 – 9.3 olup optimum 7.0 ‘dır. %7.5 tuzda üreyebilir. Bacillus cereus; lesitinaz, proteaz, amilaz (jelatinaz) aktivitesine sahiptir.

B. cereus ‘un çok sayıda alınması [10⁶ /g (10⁶ /ml)] ile bireylerde gıda zehirlenmesi görülebilir. Özellikle B. cereus kontamine olmuş gıdalar pişirildikten sonra yeterince ve hızlı soğutulmadıklarında veya gıdaların hazırlandıktan sonra geç tüketildiğinde, canlı ve ısıya dirençli olan sporların çimlenmesi ile mikroorganizma çoğalıp, gıda zehirlenmesine neden olabilecek düzeyde toksin oluşturabilir. B.cereus ile oluşmuş besin zehirlenmelerinin birçoğu Çin restoranlarında kızarmış pirinç yiyenlerde görülmüş ve bu durum pirincin kızartılmasından önce hafif haşlanıp oda sıcaklığında bekletilmesi sırasında B.cereus ‘un sporlu şeklinden vejetatif formuna dönüşmesi ve toksin salması ile açıklanmıştır. B.cereus zehirlenmelerinde pilav, kaynak bir besin olarak bildirilmiştir.

B. cereus gıda zehirlenmesine neden olan ekstrasellüler toksin, ortamdaki bakteri sayısı belirli bir düzeye ulaştıktan sonra saptanabilir. Bakteri, toksini logaritmik faz sırasında sentezler ve salgılar. Yapılan çalışmalarda bu bakterinin 18 – 44 ^oC arasında toksin sentezlediği ve 45 ^oC ‘de üremesinin durduğu tespit edilmiştir.

Toksin Oluşum Özellikleri

Bacillus cereus iki farklı toksin oluşturur. Bunlardan birisi 40 kDa(kilodalton) ağırlığında ısıya dayanıklı (emetic) [Stabil Toksin; ST] bir protein olan enterotoksindir. Gıda zehirlenmesine neden olan bu toksin 126 ^oC ’de 90 dakikada inaktif hale gelir. Diğer toksin ise 5 – 7 kDa ağırlıkta, ısıya dayanıklı (Labil Toksin; LT) olan bir peptittir. 60 ^oC ’de birkaç dakikada tahrip olur.

Hastalık belirtileri

İshal, kusma, karın krampları, bulantı.

Teşhis

Gıda kaynaklı salgınlarda B. cereus’un teyidi için:

1- Şüpheli gıdadan ve dışkıdan veya hastanın kusmuğundan aynı serotipe ait suşların izolasyonu

2-Gıda kaynaklı hastalığa neden olan şüpheli gıdadan veya dışkıdan veya hastanın kusmuğundan yüksek sayılarda B. cereus serotip izolasyonu

3-Şüpheli gıdadan B. cereus

İlgili gıdalar

Çok çeşitli gıdalarda bulunur. Bunların içinde, et, süt, sebze ve balık gibi gıdalar ishal tipi gıda zehirlenmesiyle alakalıdır. Kusma tipi salgınlar, genellikle pirinç ürünleri ile alakalıdır; bununla beraber patates, makarna ve peynir ürünleri gibi bulaşmış nişastalı gıdalar da bu tip salgınlarla alakalıdır. Soslar, pudingler, çorbalar, güveç, börek ve salatalar gibi gıda karışımları gıda zehirlenmeleri vakalarında sıklıkla sorumlu olmaktadır.

Önleme

Yeterli depolanmış, ısıtılmış ve pişirilmiş gıdalar kusturucu olmayan tipler için güvenlidir. Kusma tipi hastalık genellikle uygun depolanmamış nişastalı gıdalarla (pirinç, makarna) alakalıdır. Uygun depolama (7 °C’nin altında sadece birkaç gün) fazla üremeyi ve toksin üretimini engeller.

Araç Gereçler

–Tüp, erlen, pipet, öze, petri kabı, bunzen beki, etüv

Kullanılacak Besiyerleri ve Kimyasallar

– Serum Fizyolojik

– Mannitol Egg-Yolk Polymyxin Agar

– Dextrose Caseine Peptone Agar

– MR-VP Broth

– Nutrient Agar

– Nutrient Broth

– Egg-Yolk

-Toz kreatin kristali

-Alfa naftol çözeltisi(% 5 lik)

-Amonyum sülfat(100 ml ‘de 53,1 gr.)

-Bazik fuksin(%90 boya )

– NaCl

-Etil alkol

Serum Fizyolojik Hazırlanması

8.5 NaCl 1000 ml damıtık su içinde çözülür. Test tüplerine yada erlenmayer, balon joje gibi cam kaplara gerekli miktarlarda dağıtılarak (9 ml, 90 ml v.b.) otoklavda 121°C de 15 dk sterilize edilir.

Egg Yolk Hazırlanışı

Yumurta, içinde %96 ‘lık etil alkol bulunan bir beherde 15 dakika bekletilir ve bu süre sonunda aseptik koşullarda beherden çıkarılarak steril bir petri kutusu kapağına yerleştirilir. Yumurta kabuğunda, aseptik koşullarda, pipetin girebileceği çapta bir delik açılır ve yumurta akı steril bir pipetle bu delikten çekilerek ayrılır. Yumurta sarısı steril bir erlenmayere steril bir pipetle ölçülü olarak aktarılır ve bir kısım yumurta sarısı üzerine dört kısım steril damıtık su eklenerek kuvvetlice karıştırılır.

Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar

Mannitol Egg Yolk Polymyxine Agar (MYP)	Gram/Litre
Kazeinli pepton	10
Et ekstraktı	1
D (-) mannitol	10
Sodyum klorür	10
Fenol kırmızısı	0.025
Agar	12
Egg-yolk emülsiyonu	100 ml
Polymiksin B sülfat	100000 IU
pH = 7.2±0.2

Mannitol (+)
mikroorganizmalar, fenol kırmızısı indikatörünün kırmızı rengini sarıya
çevirmesiyle mannitol (-) mikroorganizmalardan ayrılır. Bacillus cereus refakatçi floranın gelişimini engelleyen
polymiksinden etkilenmez. Bu nedenle polymiksin yüksek miktarda refakatçi
floranın gelişimini engellediği için besiyerine eklenmelidir. İnkübasyon süresi
32  ^oC ‘de 18 – 40 saattir.

 

 

 

 

 

Dextrose
Caseine Peptone Agar (Merck 1.10860)

Dehidre besiyeri
27 g/L olacak şekilde distile su içinde ısıtılarak eritilir ve deney tüplerine
15 ‘er ml olacak şekilde dağıtılıp otoklavda 121 ^oC’ de sterilize
edilir. Hazırlanmış besiyeri berrak ve menekşe renklidir. Buzdolabında 2 aya
kadar depolanabilir.

Formül	Gram/Litre
Bromkresol mor	0.04 g
Kazein pepton	10 g
Dekstroz	5 g
Agar	12 g
pH = 6.9±0.2

 

Nutrient Agar

Bileşenler
1 litre damıtık su içinde çözdürülür. Agar eriyene dek kaynar su banyosunda
tutulur ve daha sonra otoklavda 121 ^oC ’de 15 dakika sterilize
edilir.

Formül	Gram/Litre
Pepton	15 g
Et ekstraktı	3 g
Sodyum klorür	6 g
D (+) glukoz	1 g
Agar	12 g
pH = 7.5±0.2

 

 

 

 

 

 

 

 

 

MR-VP Broth
(Merck 1.05712)

Dehidre besiyeri
17 g/L olacak şekilde distile su içinde ısıtılarak eritilir ve deney tüplerine
5 ‘er ml olacak şekilde dağıtılıp otoklavda 121 ^oC ‘ de 15 dakika
sterilize edilir. Besiyeri berrak ve sarımsı renklidir. Buzdolabında 2 aya
kadar depolanabilir.

Formül	Gram/Litre
Tamponlu pepton	7 g
Glukoz	5 g
Dipotasyum fosfat	5 g
pH = 6.9±0.1

Nutrient Broth(Merck 1.05443)

Çok amaçlı genel
besiyeridir. Dehidre besiyeri 8 g/L konsantrasyonda olacak şekilde distile su
içinde gerekirse ısıtılarak eritilir, amaca uygun kaplara (tüp, erlen vb.)
dağıtılıp otoklavda 121 ^oC ‘da 15 dakika süre ile sterilize edilir.
Hazırlanmış besiyeri berrak ve sarımsı renkli olup, pH ‘sı 25 ^oC ‘da
7,0±0,2 ‘dir. 500 g olan 1 kutu dehidre besiyeri ile 62,5 litre besiyeri
hazırlanır

Nutrient Broth(toz halinde)	8 g
Etli pepton	5g
Et ekstraktı	3g

Bazik Fuksin:
1 gr. Bazik fuksin(%90 boya içerikli) 1 lt. damıtık su içinde çözdürülür.

Kristal viyole boyası: Kristal violet(gentian violet) 0,5g:distile su 100 ml bileşimindedir. Boya distile su içine çözündükten sonra kaba filtre kâğıdından geçirilir.

İyot-Lugol çözeltisi: Potasyum iyodür 2 g:İyot kristali 2 g: Distile su 300 ml bileşimindedir. Potasyum iyodür distile su içerisinde iyice çözündükten sonra iyice ezilmiş iyot kristali ilave edilir. Tam bir çözünme sağlanana kadar karıştırılır.

İdentifikasyon Sonrası Uygulanan
Biyokimyasal Testler

Glikoz Testi

Dextrose Casein-Peptone Agar (Merck 1.10860) besiyerinde yapılabilir. Tüplerde sterilize edilmiş besiyeri standart analiz yöntemine göre kullanımdan hemen önce kaynar su banyosunda tutularak eritilir ve tekrar hızla dik pozisyonda 30 ^oC ‘a soğutulur. Bu işlemden amaç besiyeri içinde bulunan oksijenin uzaklaştırılmasıdır. B. cereus olduğundan kuşku duyulan kolonilerden elde edilen saf agar kültüründen bir koloni alınarak aşı iğnesi ile bir defada Dextrose Casein-Peptone Agar besiyerine daldırma yapılır. 30 ^oC ‘de 24 saat inkübasyon sonunda tüpün tümünün sarı renk alması pozitif reaksiyon olarak değerlendirilir. B. cereus bu testte pozitif sonuç verir.

Voges-Proskauer Testi

MR-VP Broth (Merck 1.05712) besiyerine saf agar kültüründen alınan bir koloni aşı özesi ile aşılanır. 30 ^oC ‘de 24 saat inkübasyon sonunda standart Voges-Proskauer
testi ile sonuç alınır B. cereus VP pozitif bir bakteridir. VP testi için 1 ml kültür steril bir test tüpüne alınır, üzerine 0.2 ml % 40 ‘lık potasyum hidroksit (Merck 1.05033) çözeltisi, 0.6 ml %5 ‘lik naftol (Merck 1.06223) çözeltisi ve birkaç kreatin kristali ilave edilir. Kuvvetlice çalkalanıp oda sıcaklığında 1 saat bırakılır. Pembe renk oluşumu VP testinin pozitif olduğunu gösterir. Reaksiyon sonucu negatif ise orijinal tüp 24 saat daha inkübe edilip tekrar VP testi yapılır. Kreatin kristalleri kullanılmadan da VP testi yapılabilir.

Nitrat Testi

Nitrat Broth Merck (1.10204) besiyeri kullanılabilir. B. cereus olduğundan kuşku duyulan kolonilerden elde edilen saf agar kültüründen 1 koloni alınarak aşı özesi ile besiyerine inoküle edilip 30 ^oC ‘ da 24 saat inkübasyona bırakılır. Bu sürenin sonunda tüpe 0,2-0,5 ml olacak şekilde birkaç damla Griess-Ilosvay’s nitrit çözeltisi Merck (1.09023) ilave edilir. 15 dakika içinde kırmızı renk oluşumu nitratın nitrite indirgendiğinin göstergesidir. Oluşan nitrit miktarı fazla ise renk sarıya dönüşebilir. Ya da test tüpüne az miktarda çinko tozu (Merck 1.08774) ilave ettikten sonra kültür çinko tozunun çökmesi için 10 dakika kendi halinde (karıştırmadan) bırakılır.
Bu süre sonunda çinko tozu etrafında pembe renk oluşumu çinko tozu reaksiyonu pozitif olarak değerlendirilir ve bu sonuç nitratın nitrite indirgenmediğini gösterir.

Jelatin Testi

Jelatin hidrolize edildiği zaman aminoasitler oluşur. Jelatin 30 – 35 ºC’de erir. Bu nedenle inkübasyon 20 – 25ºC ’de yapılmalıdır. Bakterinin ürettiği proteolitik jelatinaz enzimi ile jelatin hidrolize olarak eski katı özelliğini kaybeder ve sıvı hale dönüşür. 4 g jelatin ve 0.8 g nutrient broth, 100 ml distile suda eritilir. 95 – 100 ºC ’de 20 dakika otoklavda sterilize edilir. Daha sonra steril petri kutularına dökülür, dondurulur. Hazırlanan petri kutularında bakterilerin 24 – 48 saatlik kültürleri ile ekim yapılır. 20 -25 ºC ’de 48 saat veya daha fazla süre ile inkübe edilir. Petri üzerine amonyum sülfat çözeltisi dökülür. Amonyum sülfat, protein çöktürücü bir maddedir. 53.1 g amonyum sülfat 100 ml suda çözünerek hazırlanır.Jelatin hidrolize edilmiş ise kolonilerin etrafında açık bir zon görülür. Eğer hidrolize edilmemiş ise koloniler çevresinde bulanıklar gözlenir.

Gram Boyama

– Preparat hazırlanır, kurutulur.

– Kristal violet solüsyonu ile boyanır.1 dakika beklenir.

– Saf su ile yıkanır ve preparat üzerine lugol solüsyonu konarak 1 dakika beklenir.

– Saf su ile yıkanır.

– Preparata alkol dökülür ve 30 saniye beklenir.

– Saf su ile yıkanır.

– Sulu fuksin dökülür ve 15 saniye beklenir.

– Saf su ile yıkanarak boya giderilir.

– Kurutma kağıdında (veya havada) kurutulur.

– Preparata immersiyon yağı konarak mikroskopta incelenir.Bu yöntemle mor görülen mikroorganizmalar gram (+) ve pembe görülenler de gram (-) olarak değerlendirilirler.

Kaynaklar

• http://www.mikrobiyoloji.org/docgoster.asp?dosya=110013100#03.02.01

• http://www.bact.wisc.edu/Microtextbook/index.php?module=Book&func=displayarticle&art_id=280

• http://www.neogen.com/pdf/Acumedia%20Product%20Information%20Sheets/BacillusCereusAgarBase.pdf

• http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/ProductDetail?ProdNo=31415&Brand=FLUKA

• http://gbl.com.tr/asp/show_stock.asp?product=1129-500G

• http://www.ziraatci.com/editor/yazigoster.asp?katid=30&editid=427&yaziid=1260&manual=off&kategori=Su%20%C3%83%C5%93r%C3%83%C2%BCnleri

• Arş. Grv. Değer Kaleli, Arş. Grv. Fügen

  Durlu-Özkaya Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği Bölümü Gıda

  Mikrobiyolojisi ve Uygulamaları