Etiket Arşivleri: PROTEİN TAYİNİ

Lowry Yöntemi Protein Ölçümü

LOWRY Yöntemi Protein Ölçümü

Deneyin İlkesi

Alkali ortamda bakır iyonu (Cu+2 ) proteinlerdeki peptid bağları ile bir kompleks oluşturur ve Cu+1’ e indirgenir. İndirgenmiş bakır ve proteinlerin yan zincirinde yer alan Tyr, Trp ve Cys aminoasitleri Folin-Fenol reaktifini indirgeyerek renk oluşumuna neden olur olur. Oluşan rengin şiddeti protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır ve 660 nm’de spektrofotometrik
olarak ölçülür.

Uygulama Basamakları

1. Örnek ve standart tüplerine 1 mL protein çözeltisi ve standart çözeltiler, kör tüpüne de 1 mL saf su koyulur.

2. Tüm tüplere 3 mL C reaktifi eklendi. (C reaktifi 100:1 oranında A ve B reaktifi karışımından oluşturulur. A reaktifi %2 Na2CO3, % NaOH, % 0.16 Na tartarat; B reaktifi ise %4 CuSO4.5H2O’dır.)

3. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir.

4. Tüm tüplere 300 μL Folin-Fenol reaktifi vortekslenerek eklenir.

5. Oda sıcaklığında 45 dakika bekletilir.

6. Absorbanslar 660 nm’de köre karşı okunur.

7. Protein miktarları oluşturulan standart kalibrasyon grafiğinden yararlanarak hesaplanır.

Referans: Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL and Randall RJ. 1951 Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: 265-275

Kjendahl Metoduyla Ham Protein Tayini

Proteinler, aminoasitlerin zincir halinde birbirlerine bağlanmasından oluşan büyük organik bileşiklerdir. Açlık anında en son tüketilir. Kimyasal sindirimi midede başlar.

Proteinler, aminoasit yapıtaşlarından oluşan polimerlerdir. Her proteinin kendisine has özelliklerinin olmasını sağlayan özel amino asit dizilimleri vardır. Proteinlerin işlevlerinin çoğu, kendisini oluşturan aminoasitlerin özelliklerinin tayin edilmesiyle anlaşılabilir. İnsandan virüse proteinlerin oluşumunda en çok kullanılan 22 çeşit amino asit vardır.

Bu zincirde bir amino asitin karboksil grubunun bir diğerinin amino grubuna bağlanmasıyla oluşan bağ peptit bağı olarak adlandırılır. Her proteindeki amino asit dizisinin sırası bir gen tarafından tanımlanır ve genetik kod ile kodlanmıştır. Genetik kod 22 “standart” aminoasit tanımlasa da proteinlerdeki aminoasitler translasyon sonrası değişimle kimyasal olarak değişikliğe uğrar. Bu değişimler ya proteinin işlev görmeye başlamasından önce gerçekleşir ya da kontrol mekanizmalarının parçası olarak, proteinin işlevini değiştirmek için olur. Proteinler belli işlevleri yerine getirmek için beraberce de çalışabilirler ve bazıları bir araya gelip kararlı kompleksler oluşturabilir (Anonim, 2006).

KJENDAHL METODUYLA HAM PROTEİN TAYİNİ

Amaç ve Kapsam

Gıda maddelerinde kjeldahl azotu miktarını klasik kjeldahl metodu ile belirlemek (Anonim, 2007)

Yöntemin Prensibi

Hayvansal ve bitkisel maddelerin, özellikle gıda maddelerinin analizinde kjeldahl metodu, azot miktarının tayini için kullanılır. Tecrübelere göre değişik ülkelerde, değişik ürünlere ve analizcilere bağlı olarak farklı işlemler uygulanmakta olduğu, bu farklı işlemler doğru olarak uygulandığında aynı sonuçları vermekte olduğu, genellikle değişik işlemlere bağlı olarak azot tayini sonuçları arasındaki farklılığın, ürünlerin heterojenliğinden kaynaklanan farklılıktan

daha az olduğu görülmektedir. Sonuç olarak kjeldahl metodu değişik cihaz ve işlemler kullanıldığında aynı sonuçlar elde edildiğinden, farklılıklar eşdeğer olarak kabul edilebilir.

Metodun prensibi, analiz için öğütülüp, karıştırmak veya benzeri işlemlerle homojen hale getirilmiş gıda örneklerinin uygun katalizörler yardımı ile derişik sülfürik asit ile 380 °C – 400°C civarında muamele edilerek organik kütlenin parçalanması, proteini oluşturan aminoasitlerin amin grubundaki ( ve protein kaynaklı olmayan diğer azot kaynaklarındaki ) NH2 formunda bulunan azotun amonyum azotuna yükseltgenmesi, amonyum azotunun da derişik NaOH ile ortamın kuvvetli alkalileştirilmesi sonucunda NH3 halinde su buharı ile birlikte destile edilerek, toplama kabındaki çözelti tarafından (borik asit veya ayarlı bir asit çözeltisi ) tutulması ve tutucu olarak borik asit kullanıldığında ayarlı bir asit çözeltisi ile, tutucu olarak ayarlı bir asit çözeltisi kullanıldığında ayarlı bir NaOH çözeltisi ile titre edilerek, azot miktarının hesaplanması ve uygun katsayılarla çarparak protein olarak ifade edilmesi ilkesine dayanır (Anonim, 2007; Anonim, 2010).

Bu yöntemde 4 aşama vardır:

  • Yaş Yakma: Homojenize edilmiş 2 g numune tartılır. Üzerine katalizör olarak 4,0012 g K2SO4 (susuz) ve 450 mikrolitre CuSO4 konur. Yakma işlemini hızlandırmak için bakır sülfat ve potasyum sülfat katalizör olarak kullanılıyor. Kaynama taşı atıldıktan sonra 10 ml derişik H2SO4 eklenir. Isı ayarı yapılarak(380 C’de 3 h) yakılır. Amaç: Proteinlerin denature olmasıdır.

  • Nötralizasyon: Meydana gelen amonyum sülfattan [(NH4)2S04) amonyağı (NH3) serbest hale getirmek için ortama kuvvetli bir baz(NaOH) ilave etmek gerekir.

  • Destilasyon: Yaklaşık 40°C ye kadar soğutulan balona 50 ml destile su konur. Karıştırılır ve soğumaya bırakılır. 1 ml’ lik erlen içine 50 ml % 4 lük H3BO3 çözeltisi konur, üzerine 3–4 damla taşiro indikatör eklenerek karıştırılır(mor renk elde edilir) ve balon adaptörün ağzı sıvıya batacak şekilde yoğunlaştırıcının altına yerleştirilir.

  • Titrasyon: Erlen içindekiler N/10 HCI ile titre edilir (Anonim, 2010; Öncül ve Ensoy, 2010).


Laboratory‎ > Lowry Metodu ile Protein Tayini

01.Kullanılan Kimyasallar

Bu yöntemde 4 farklı çözelti kullanaılır.

A çözeltisi: 20 g. Na2CO3 tartılır. 0,1 N NaOH çözeltisi ile çözündürülür ve yine 0,1 N NaOH çözeltisi ile litreye tamamlanır.

B çözeltisi: 0,5 g. CuSO4.5H2O tartılır.% 1’lik sodyum sitrat ile 100 ml’ye tamamlanır.

C çözeltisi: 50 ml a çözeltisi ve 1 ml B çözeltisi karıştırılarak hazırlanır. Bu çözelti çok açık mavi renklidir.

D çözeltisi: Hazır halde alınan fenol çözeltisi kullanılmadan önce damıtık su ile 1/1 oranında seyreltilir.

02.Analizin Yapılışı:

Bir deney tüpüne 0,2 ml protein çözeltisi alınır. Üzerine 5 ml C çözeltisi ilave edilir. Tüp 370C deki su banyosunda 10 dakika süreyle tutulur. Süre sonunda tüp içeriğine 0,5 ml fenol çözeltisi ilave edilir. Reaksiyon sonunda renk mavi olur.  Tekrar su banyosuna konularak  370C de 10 dk daha tutulur. Süre sonunda damıtık suya karsı 750 nm’de spektrofotometrede absorbans değeri belirlenir.
Lowry protein tayininde standart kurve eğrisi hazırlamada BSA(Boune Serum Albinin) kullanılır. 93,9 mg BSA damıtık suyla 100 ml’ye seyreltildiğinde & 0,1 lik bir protein çözeltisi hazırlanmış olmaktadır.