Etiket Arşivleri: Lowry Metodu

Lowry Yöntemi Protein Ölçümü

LOWRY Yöntemi Protein Ölçümü

Deneyin İlkesi

Alkali ortamda bakır iyonu (Cu+2 ) proteinlerdeki peptid bağları ile bir kompleks oluşturur ve Cu+1’ e indirgenir. İndirgenmiş bakır ve proteinlerin yan zincirinde yer alan Tyr, Trp ve Cys aminoasitleri Folin-Fenol reaktifini indirgeyerek renk oluşumuna neden olur olur. Oluşan rengin şiddeti protein konsantrasyonu ile doğru orantılıdır ve 660 nm’de spektrofotometrik
olarak ölçülür.

Uygulama Basamakları

1. Örnek ve standart tüplerine 1 mL protein çözeltisi ve standart çözeltiler, kör tüpüne de 1 mL saf su koyulur.

2. Tüm tüplere 3 mL C reaktifi eklendi. (C reaktifi 100:1 oranında A ve B reaktifi karışımından oluşturulur. A reaktifi %2 Na2CO3, % NaOH, % 0.16 Na tartarat; B reaktifi ise %4 CuSO4.5H2O’dır.)

3. Oda sıcaklığında 30 dakika bekletilir.

4. Tüm tüplere 300 μL Folin-Fenol reaktifi vortekslenerek eklenir.

5. Oda sıcaklığında 45 dakika bekletilir.

6. Absorbanslar 660 nm’de köre karşı okunur.

7. Protein miktarları oluşturulan standart kalibrasyon grafiğinden yararlanarak hesaplanır.

Referans: Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL and Randall RJ. 1951 Protein measurement with the folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry 193: 265-275

Laboratory‎ > Lowry Metodu ile Protein Tayini

01.Kullanılan Kimyasallar

Bu yöntemde 4 farklı çözelti kullanaılır.

A çözeltisi: 20 g. Na2CO3 tartılır. 0,1 N NaOH çözeltisi ile çözündürülür ve yine 0,1 N NaOH çözeltisi ile litreye tamamlanır.

B çözeltisi: 0,5 g. CuSO4.5H2O tartılır.% 1’lik sodyum sitrat ile 100 ml’ye tamamlanır.

C çözeltisi: 50 ml a çözeltisi ve 1 ml B çözeltisi karıştırılarak hazırlanır. Bu çözelti çok açık mavi renklidir.

D çözeltisi: Hazır halde alınan fenol çözeltisi kullanılmadan önce damıtık su ile 1/1 oranında seyreltilir.

02.Analizin Yapılışı:

Bir deney tüpüne 0,2 ml protein çözeltisi alınır. Üzerine 5 ml C çözeltisi ilave edilir. Tüp 370C deki su banyosunda 10 dakika süreyle tutulur. Süre sonunda tüp içeriğine 0,5 ml fenol çözeltisi ilave edilir. Reaksiyon sonunda renk mavi olur.  Tekrar su banyosuna konularak  370C de 10 dk daha tutulur. Süre sonunda damıtık suya karsı 750 nm’de spektrofotometrede absorbans değeri belirlenir.
Lowry protein tayininde standart kurve eğrisi hazırlamada BSA(Boune Serum Albinin) kullanılır. 93,9 mg BSA damıtık suyla 100 ml’ye seyreltildiğinde & 0,1 lik bir protein çözeltisi hazırlanmış olmaktadır.