Etiket Arşivleri: Gram boyama

Mikrobiyolojik Ekim, Sayım ve Boyama Yöntemleri

Mikrobiyolojik Ekim, Sayım ve Boyama Yöntemleri

MİKROORGANİZMA EKİM YÖNTEMLERİ ve SAYIMI:

Tanım: Gıda maddesi üzerinde bulunan mikroorganizmaların sayılarının belirlenmesi amacıyla yapılan ekim işlemidir.

Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi: Bir gıda maddesinde mikroorganizma sayısı belirlenerek o gıdanın gıda tüzüğünde belirtilen değerlere uygunluğunun saptanarak, sağlıklı olup olmadığı belirlenir.

Gıda Örneklerinde Toplam Bakteri Sayımı:

Özet: Bu yöntem fermente gıdalar gibi doğal niteliği yönünden yüksek sayıda mikroorganizma  içerenler dışında bir çok gıdada kalite kriteri olarak kullanılır. Yöntemlerde belirtilen besi ortamlarına ekilen gıda örneği seyreltimleri belli süre ve sıcaklıkda, aerobik koşullarda inkübe edilir. Toplam bakteri sayımında, dökme ve yayma plak teknikleri gibi kültürel sayım yöntemleri kullanılır.

  1. Dökme Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:

Materyal:

  • Mikroskop

  • Otoklav

  • Etüv(220°C’ye kadar ayarlanabilir)

  • Su banyoları

  • Stomacher veya blender

  • Bunzen beki

  • Steril pens

  • Tüp karıştırıcı

  • Steril drigaski , özeler

  • Cam veya plastik steril petriler

  • Steril pipetler

  • Deney tüpleri ve tüp taşıyıcıları

  • Erlen, beher

  • Plate Count Agar(PCA),EMB

  • Mercimek

Metot:

      10g gıda maddesi tartılır ve 90ml fizyolojik su içine konur. Bu karışım stomacher’de homojenize edilir. Bu dilisyon  –1 dilisyonudur.

      –1 dilisyonundan  1ml alınır ve içinde 9 mlt fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –2 dilisyonudur.

      –2  dilisyonundan 1 ml alınarak içinde 9 ml fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –3 dilisyonudur.

      Üzerlerine seyreltim değerleri yazılmış petri kutularına –1,-2,-3 dilisyonlarından 1’er ml konulur. Petriler üzerindeki numaralar seyreltim numaraları  ile aynı olmalıdır.

      Agarlı besi ortamı kaynar su banyosunda 45°C’ye kadar soğutulur. Her petriye 15-20 ml besi yeri dökülür.

      Petrilere hafif salınım hareketi verilerek örnek ile besi yerinim karışması sağlanır.

      Besi ortamı katılaştıktan sonra  petriler ters çevrilerek 25°C’ de 24-48 saat inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:

  • Plate Count Agar (PCA):

  • Trypton 5 gr

  • Yeast agar 2,5 gr

  • Glukose 1 gr

  • Agar 15 gr

  • Destile su 1 lt

  • Eosin Methylen Blue Agar (EMB):

  • Pepton 10 gr

  • Laktoz 10 gr

  • K2HPO4 2 gr

  • Agar 15 gr

  • Eosın Y 0,4 gr

  • Methylen Blue 0,065gr

  • Destile su 1 lt

  1. Yayma Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:

Materyal:

Gerekli cihaz ve malzemeler  dökme plak yönteminde anlatıldığı gibidir. Yalnız burada besi yeri olarak DRBC agar kullanılır. Bu besi yeri ile küfler sayılır.

Metot:

      –1,-2,-3 dilisyonları daha önce anlatıldığı gibi hazırlanır.

      Boş petrilere 15-20 mlt besi yeri dökülür. Besi yerinin donması beklenir ve üzerine her dilisyondan  0,1 er  mlt  pipetle aktarılır.

      Petrilere 0,1 er mlt örnek koyulduğu için bir kez daha seyreltim yapılmış gibi sayılır ve petrilere koyulan seyreltim derecesinden bir düşük sayı ile numaralandırılır:-1® -2

      Koyduğumuz örnekleri drigaski ile agarın yüzeyine yayarız.

      25°C de 5-7 gün inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:

  • DRBC Agar:

  • Glukoz 10 gr

  • Bakteriyolojik pepton 5 gr

  • KH2PO4 1 gr

  • MgSO4.7H2O 0,5 gr

  • Rose bengal 0,5 mlt

  • Dikloran 1 mlt

  • Kloram fenikol 0,1 gr

  • Agar 15 gr

  • Damıtık su 1000 mlt

  1. Direkt Ekim Yöntemi:

Materyal:

  • Malt Extract Agar(MEA)

  • Nohut

  • Diğer materyaller daha önceki yöntemlerde kullanılan materyallerdir.

Metod:

      Behere 50 gram nohut konur. Üzerini kaplayacak kadar %4’lük NaOCl ile 1 dakika boyunca çalkalanır.

      Daha sonra bu çözelti dökülüp nohutlar beher içinde steril su çalkalanır.

      Steril su dökülüp tekrar steril su eklenir, çalkalanır ve dökülür.

      Beş adet nohut steril bir pensle alınıp dikkatli bir şekilde besi yerine konulur. Nohutların petri kutusu içinde kaymamasına, birbirlerine değmemesine ve besi yerinin nohutlar dikilirken yırtılmamasına özen gösterilmelidir.

Kullanılan Maddeler:

  • Malt Extract Agar:

  • Malt Extract 30g

  • Agar 20g

  • Destile su 1 lt

Mikroorganizma sayısının belirlenmesi:

Petri kutusunda sayım yaparken bakteriler ve mayalar için 25-250 koloni gelişmiş petriler seçilirken, küfler için ise 10-25 koloni gelişen petriler seçilir. Mikroorganizma sayısı aşağıdaki formül ile bulunabilir:

Mos. sayısı (cfu/g) = Petrideki koloni sayısı * petri kutusuna ekilen miktar (ml) /seyreltme oranı

 Hata Kaynakları:

  • Dökülen besi yerlerinin petri kutusuna iyi dağıtılamaması.

  • Katı parçacıklar bulunan besi yeri dökülmesi.

  • Yeterli seyreltme yapılamaması.

  • Sayım yaparken dikkat edilmemesi.

BOYAMA YÖNTEMLERİ ve MİKROORGANİZMALARIN BOYANMASI:

Tanım:

Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile görülmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta görünür hale getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyanmaları işlemine “mikroorganizmaların boyanması”denir.

Boya bir benzen halkasına bağlı kromofor ve okzokrom gruplarını taşıyan organik bir bileşiktir. Kromofor grup moleküle renk özelliği verir, ancak bu bileşik renkli olmasına rağmen henüz boya karakterinde değildir. Bu maddenin herhangi bir ortama tutunma özelliği yoktur. Bu özellik okzokrom grubu ile sağlanır. Okzokrom grubu moleküle elektrolitik çözünme özelliği vererek tuz meydana getirilmesini sağlar. Okzokrom grubu boyanın renk tonunu değiştirebilir. Ancak rengin ortaya çıkmasını sağlayamaz.

Boya Çeşitleri:

  • Bazik Boyalar: Bazik fuksin, Kristal violet, Metilen mavisi, Safranin.

  • Asit Boyalar : Nigrosin, Eosin, Asit fuksin.

  • Nötr Boyalar : Giemsa, Leishman

Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi:

Boyama yöntemleri ile mikroorganizmaların sınıflandırılması ve tanımlanması, genel olarak şeklinin gözlenmesi mümkündür. Boyama ile bir gıda ürününün ekim işleminden sonra açığa çıkan kültürlerden şüphe duyulanların hangi mikroorganizmalar olduğu belirlenir. Böylece insan sağlığı açısından güvenilir bilgiler elde edilebilir. Ayrıca boya maddeleri mikroorganizmaların boyanmasının dışında başka amaçlar için de  kullanılmaktadır. Örneğin trifenil içeren bazı boyalar bazı mikroorganizmalar üzerine öldürücü etkiye sahip olduklarından, mikroorganizmaların izolasyonunda besi yerine inhibitör ajan olarak ilave edilmektedir. Böylece istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önleyerek besi yerine seçici özellik kazandırır.

Boyama Yöntemleri:

  • Basit Boyama

  • Gram Boyama

  • Endospor Boyama

  • Flagella Boyama

  • Kapsül Boyama

  • Küf Boyama

  1. Gram Boyama

Tanım:

Mikrobiyolojide çok kullanılan bir yöntemdir. Bakteriler bu yöntemle iki gruba ayrılırlar. Mor-menekşe renge boyanmış mikroorganizmalar gram pozitif, pembeye boyananlar ise gram negatif olarak tanımlanırlar. Bazı mikroorganizmaların yaşlandıkça gram reaksiyonlarında değişiklik olabileceğinden 18-24 satlik genç kültürlerden hazırlanan preparatlar kullanılmalıdır.

Materyal:

  • Lam

  • Öze

  • Besi yerinde bakteri kültürü (PCA petrisinde)

  • Boya çözeltileri: Crystal violet, gramın iyot çözeltisi, safranin veya sulu fuchsin

  • %95’lik etil alkol

  • Kurutma kağıdı

  • İmmersiyon yağı

  • Mikroskop(100Xobj.)

Metod:

  1. a) Preparat Hazırlanması:

      Temiz bir lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır.

      Öze bunzen alevinde sterilize edilir,soğuması için kısa süre beklenir.

      Steril öze ile katı besiyerinden bir miktar kültür alınır.

      Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır.

      Öze bunzen alevinde sterilize edilip,yerine konur.

      Preparatın kuruması için bir süre beklenir.

      Bir pens yardımıyla bir ucundan tutulan lam bunzen  aleviden  3 kere geçirilir.

  1. b) Boyama Yöntemi:

      Uygulamada hazırlanan preparat üzerine crysal violet damlatılarak 1-2 dak. beklenir.

      Su ile hafifçe yıkanarak boyanın fazlası akıtılır.

      Lugol çözeltisi damlatılarak 1 dak. bekletilir.Sürenin sonunda Lugol çözeltisi akıtılır.

      Preparat %95’lik etil alkol ile yıkanır.(10-15 sn )

      Preparat, saf sudan geçirildikten sonra sulu carbol fuchsin çözeltisi ile 10-30 saniye boyanır.

      Damıtık su ile iyice yıkanır ve kurulama kağıdı ile hafifçe suyu alınır ve kurumaya bırakılır.

      İmmersiyon objektifi ile mikroskopta incelenir.

Kullanılan çözeltiler:

  • Crystal Violet Çözeltisi:

  • Crystal Violet 50 g

  • Damıtık Su 00 ml

  • Lugol çözeltisi

  • İyot 00 g

  • KI 00 g

  • Damıtık Su 00 ml

  • Carbol Fuchsin (Ziehl-Neelsen)

  • Basic fuchsin 00 g

  • Etanol (%95) 00 ml

  • Fenol (%5’lik çözeltisi suda) 00 ml   

  1. Küf Boyama:

Materyal:

  • Lam

  • Öze

  • Küf kültürü

  • Lactofenol

  • %95’lik etil alkol

  • Kurutma kağıdı

  • İmmersiyon yağı

  • Mikroskop

  • Lamel

Metot:

      Temiz bir lam üzerine bir damla lactofenol çözeltisinden damlatılır.

      İğne uçlu öze ile spor yapısını içeren kültür bir miktar besiyeri ile birlikte alınarak çözelti üzerine konur.

      Üzerlerine bir damla alkol damlatılıp hava kabarcığı kalmayacak şekilde lamel kapatılır.

      Preparat mikroskopta incelenir.

Kullanılan Çözeltiler: 

  • Lactofenol Çözeltisi:

  • Fenol (kristal) 20 g

  • Laktik Asit 20 g

  • Gliserol 40 g

  • Saf su 100 ml

Hata Kaynakları:

  • Yeterli steril koşullarda çalışmama.

  • Besi yerinden kültür alımına dikkat etmeme.

  • Preparat alınırken kültürün lam üzerindeki su ile iyice karıştırılmaması.

  • Mikroorganizmaların lam üzerine iyice fiksasyon edilmemesi.

  • Damlatılan boyaların gereğinden fazla veya az damlatılması.

  • Bekleme sürelerinin yeterli olmaması.

  • Su ile yıkamada mikroorganizmaların kayıp olması.

  • Kurutma kağıdının fazla bastırılması.

  • Küf boyamada lamelin hava alacak şekilde kapatılması.

Ekler:

→Gıdadaki mikroorganizmaların tüm yüzeye yayılması için parçalama işlemi yapılır. Bu işleme homojenizasyon denir. Homojenizasyonda üç tip alet kullanılır:

Stomacher: Dilüsyon sıvısı  içinde bulunan maddeyi pedalları ile döverek parçalayıp sıvıya homojen olarak dağıtan alettir.

Blender: İçinde bulunan bıçağın dönmesi sonucu homojenizasyon sağlayan alettir.

-Top drive homogenizer: Bıçağın üstten aşağıya dönerek inmesiyle homojenizasyon sağlayan alettir.

Gram pozitif bakterilerin alkol ile muameleden sonra crystal violet-iyot kompleksini bırakmamalarının nedeni hücre duvarının özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Gram-negatif bakterilerde ince bir peptidoglycan tabaka bulunur ve yağ oranı daha fazladır. Gram-pozitif bakterilerde ise peptidoglycan tabaka daha kalındır. Gram boyamanın uygulanmasından sonra oluşan crystal violet-iyot kompleksi, alkol ile yıkamada gram pozitif bakterilerde kalın peptidoglycan tabakadan çıkamaz ve hücre içinde kalarak hücrenin mor renkte görünmesine neden olur. Gram negatif bakterilerde ise alkol, hücre duvarının dışındaki lipopolisakarid tabakada delikler oluşturur. Böylece alkolden sonraki su ile yıkamada boya yıkanır ve gram negatif bakteriler başlangıçtaki şeffaf durumlarına dönerler. Bu aşamadan sonra bakteriler karşıt boya olan safranin ile boyandıklarında boyayı tuttukları için renkleri pembe-kırmızı görünür. Gram pozitif bakterilerde safraninin bir etkisi olmadığı için hücrenin renginde son olarak bir değişiklik  meydana gelmez.

Sonuçlar ve Bulgular:

Dökme plak – PCA: 46.102

                        EMB: 1.102   

Yayma plak – DRBC: 2.104

Direk ekim – MEA: Oğuzhan – %60

                                 Nükhet    – %80

                                 Serli        – %100

                                 Serpil      – %100

  Referanslar:

      HEPERKAN, D. 1998, Gıda Mikrobiyolojisi Ders Notları, İstanbul

      Gıdalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri, Tübitak

      GÜRGÜN,V.; A.K. HALKMAN. 1998 Mikrobiyolojide Sayım Yöntemleri. Gıda Teknolojisi Yayınları, Yayın No:7, Ankara

Diferansiyel ( Ayırtedici ) Boyama

Diferansiyel (Ayırtedici) Boyama

Bakterilerin gruplarını ayırtetmek için kullanılır.

Gram Boyama

Asit-Fast Boyama

GRAM BOYAMA

En önemli ve en sık kullanılan ayırdedici bir boyama tekniğidir.

Bakterileri hücre duvarlarının kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre iki büyük gruba ayırmak için kullanılan bir yöntemdir.Bakteri örneğinin tanılanmasında ilk aşama olan Gr(+)/ Gr (-) ayırımının yapılmasında kullanılır.

Bu metodu bulan kişi Danimarkalı bilim adamı Hans Christian Gram’dır.

Bakteriler Gr(+) ve Gr (-) olarak iki ana gruba ayrılırlar. Bu farklılık gram boyama reaksiyonundan kaynaklanır. Gram reaksiyonu ise bakterilerin hücre çeperi farklılıklarından temellenir.

Cell walls of bacteria(1)

Peptidogikan yapısı

The Gram-negative outer membrane(1)

Gram-Negatif ve
Gram-Positif Bakteriler Arasındaki Farklılıklar

Gram Boyama Prosedürü

Gram Boyama

Gram boyama – karışık kültür

Mikrometrik lam (her aralık 10 µm= 0,01mm)

ÖrnekMikrometrik okülerde bir streptobasilin  boyu 5, eni 1  aralıktır.  Mikrometrik okülerin 10 aralığı mikrometrik lamın 1 aralığına eşit ise basilin eni ve boyu kaç µm’dir?

Gram Boya Metodu

Genel Bilgi: Birkaç modifikasyonu olmakla beraber Gram boyama yönteminde temel ilke Olarak, tesbit edilmiş preparatın üzerine kristal viyole boyası ve gram iyot eriyiği (lugol) uygulandıktan sonra %95’lik etil alkol ile renksizleştirme işlemi yapılır ve sonra zıt bir boya eriyiği ile (sulu fuksin veya safranın gibi) uygulanarak yöntem tamamlanır. Bakterilerin büyük bir çoğunluğu bu boyama ile gram (+) veya gram (-) olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Gram boyama yönteminde önce uygulanan kristal viyole ve mordan olarak kullanılan iyot eriyiğinin uygulanmasından sonra preparattaki boyanabilir tüm bakteriler boyayı alırlar. Mordanlar boyaların nüfuz kabiliyetini artırır ve daha iyi boyanmalarını sağlarlar. Alkol ile yapılan renksizleştirme işleminde gram (+) bakterilere aldıkları boyayı bırakmazlar. Gram (-)’ler ise boyayı bırakarak renksizleşirler. Bunlarda son uygulanan zıt boya (sulu fuksin vs.) ile boyanırlar. Bu suretle gram (+) bakteriler mor, gram (-)’ler zıt boya renginde (sulu fuksin ile pembe-kırmızı) boyalı olarak görünürler. Bazı bakteriler gram (+) oldukları halde eskiyen kültürlerinde gram (-) varyantlar oluştururlar. Bazıları ise gram (+) oldukları halde alkolün biraz fazlaca uygulanması ile boyalarını bırakabilirler. Bunlara gram değişken bakteriler denir. Gram (+) mekanizması olayının bakterilerin hücre çeperi yapısına bağlı olduğu bilinmektedir. Gram (+) bakterilerin hücre duvarları gram (-)’ den farklıdır. Bunlardaki peptidoglikan katmanı daha kalındır. Bu şekilde tüm hücre çeperinin %50’si peptidoglikandan ibarettir. Ayrıca çoğunda gram (-)’lerde bulunmayan teikoik asit bulunur. Gram (-)’lerin hücre duvarında ise farklı olarak bir lipopolissakkarit katmanı vardır. Bunlarda peptidoglikan yapı incedir. Her iki grup bakteride kristal moru ve lugolun hücre duvarını geçerek hücrenin içine girdikleri, gram (+)’larda bu boyaların hücre çeperi ile zor ayrılabilen bileşikler yaptığı bilinmektedir. Kristal Viyoletin Hazırlanması : Kristal viyolet 1g. Asit – Fenik kristali (fenol kristali) 2 g. Etil alkol (% 96) 10 mL. Distile su 100 mL. Kristal viyolet ve fenol kristali porselen havanda ezilir ve etil alkol yavaşça eklenir.

Lugol solusyonunun hazırlanması: Gram boyama yönteminde mordan olarak kullanılır. İyot 1 g. veya İyot 5 g. KI 2 g. veya KI 10 g. Distile su 300 cc. veya Distile su 100 cc. İyot ile KI havanda iyice ezilir. Sonra distile su yavaş yavaş katılır ve iyice karıştırılır. Sonra şişeye aktarılır. Kahverengi şişelerde saklanır. Bazik Fuksin (Stok Solüsyon) Bazik Fuksin 10 g %95 lik Etil alkol 100 ml Bazik fuksin havanda ezilir ve alkolle eritilir, 370 °C’de bir gece bekletildikten sonra filtre kağıdında süzülür ve cam kapaklı şişelerde saklanır. Sulu Fuksin Solüsyonu Bazik fuksin (stok) 10 ml Distile su 100 ml Fuksin distile suda iyice karıştırılır ve filtre kağıdında süzülür. (Tıbbi Laboratuvar Mikrobiyolojik Preparat Hazırlama, MEB,Ankara, 2011) Deneyin Yapılışı: 1) Sıvı ve katı kültür ortamından öze ile alınıp lam üzerine yayılan bakteri kültürünün havada kuruması sağlanır. 3 defa alevden geçirilerek fiziksel tesbit yapılır. 2) Lam ( préparât ) boya kabına konarak, kristal viyole ile 1 dakika boyanır. 3) 1 dakika sonra kristal viyole boya kabına dökülür. 4) Lam üzerinde kalan boya üzerine lugol ilavesi yapılır. 1 dakika beklenir. 5) 1 dakika sonra boya kaba dökülerek, % 95′ lik Etil Alkol ve su ile boya akmayıncaya kadar yıkama İşlemi yapılır. 6) Bu işlemden sonra lam üzerine (preparat) safranin dökülerek 15-20 saniye dakika beklenir. Boya dökülüp, lam yıkanarak kurulanır. Bir damla immersiyon yağı damlatılarak mikroskopla

incelenir ( 100 x ). Objektif sahasında görülen mor renkli bakteriler Gram (+), pembe renkli olanlar ise Gram ( – ) olarak adlandırılır. Gram boyama değerlendirme çizelgesi İşlem Yöntem Sonuç Gram (+) Gram (-) İlk boya Kristal viole ile 1-2 dk Mor renk Mor renk Lugol (mordan) Lugol ile 1 dk Mor renk Mor renk Renk giderme %95’lik alkol ile 20-30 sn Mor renk Renksiz Zıt boyama Sulu fuksin ile 20-30 sn Mor renk Pembe renk (sulu fuksinin rengi) Sonuç; gram (+)’ler ilk boya olan kristal violenin rengi olan mor renk, gram(-)’ler zıt boya olan sulu fuksinin rengi pembe renge boyanır.