Etiket Arşivleri: Enzim Kinetiği

Enzimler Nasıl Çalışır? Enzim Kinetiği ( Dr. Gülçin Eskandari )

nEnzimler Nasıl Çalışır Enzim Kinetiği

nDr. Gülçin Eskandari

nEnzimler nasıl çalışırlar?

nOldukça etkili katalizörler

nReaksiyon hızını ­

nEnzimlerin oldukça büyük yapılarına karşın, kataliz işleminin gerçekleştiği yer aktif bölge

nEnzimlerin aktif bölgesi substrat özgünlüğü de gösterir

nEnzimler nasıl çalışırlar?

nSubstrat özgünlüğü, substrat bağlama bölgesindeki amino asidlerin yapısı, yükleri, polarite ya da hidrofobisiteleriyle belirlenir

nEnzimin substrat bağlaması hidrojen bağı, hidrofobik ya da iyonik etkileşim gibi zayıf bağlarla olur

nBazı enzimler tek bir substrata özgünlük gösterirken, bazıları daha geniş bir spektrumu katalizlerler

nEnzimler nasıl çalışırlar?

nBir reaksiyonun hızı geçiş aşamasına (transition state) birim zamanda geçen substrat konsantrasyonu ile orantılı

nAktivasyon enerjisinin yüksek olması hızı düşürür

nHızı arttırmak, ya ısıyı arttırarak reaksiyona girecek substratların enerjisini arttırmakla (collision theory) ya da aktivasyon enerjisini düşürmekle mümkün

nCanlı organizmalarda bu işlem aktivasyon enerjisinin düşürülmesi, yani reaksiyonları enzimlerin katalizlemesiyle gerçekleşir

nEnzimle katalizlenen reaksiyonların hızı artarken DG ya da Keq değerlerinde herhangi bir değişiklik olmaz

nReaksiyonun hızı reaksiyona giren moleküllerin konsantrasyonu ile doğru orantılı

nReaksiyon hızı

nBir internasyonel ünite enzim miktarının, belirlenen şartlar altında bir mmol ürünü bir dakikada oluşturması

nReaksiyon hızını etkileyen faktörler

nIsı

npH

nEnzim konsantrasyonu

nSubstrat konsantrasyonu

nİnhibitör varlığı

nIsı

npH

nSubstrat ve enzim konsantrasyonu

nEnzim kinetiği

  1. Varsayım: E + P oluştuktan sonra geri dönüş reaksiyonunu ihmal ediyoruz

  2. Varsayım: ES hem oluşuyor, hem de yıkılıyor, ancak bu iki işlem dengede ve ES konsantrasyonu değişmiyor

  Bu durum steady state’ kararlı denge durumu  

nMichealis – Menten Denklemi

nMichealis – Menten Grafiği

nEğer [S] << Km ise hız substrat konsantrasyonu ile doğru orantılı

nEğer  [S] >> Km ise hız Vmax’ta

nLineweaver
Burk
Grafiği

nDüzenli mekanizmayla bağlanma

nRasgele mekanizmayla bağlanma

nDüzenli ya da rastgele mekanizmaların her ikisinde de ping-pong mekanizmasıyla bağlanma olabilir.

nBirden fazla substratı olan enzimler için Lineweaver
Burk
grafiği denklemi

nENZİM İNHİBİSYONLARI

nKompetetif (yarışmalı) İnhibisyon

nSüksinat dehidrogenaz

nKompetetif (yarışmalı) İnhibisyon

nNonkompetetif İnhibisyon

nNonkompetetif İnhibisyon

nNonkompetetif inhibisyon’da kinetik açıdan değişen nedir?

nNonkompetetif İnhibisyon

nUnkompetetif İnhibisyon

nİrreversible inhibisyonlar

nEnzim aktivitesi için gerekli olan, enzimin fonksiyonel bir grubu ile birleşerek ya da bu fonksiyonel grubun yapısını bozarak etki gösterirler

nİrreversible inhibitör ile enzim arasında kovalent bir bağ oluşumu olabilir

nİrreversible inhibisyonlar

nİodoasetamid aktif bölgesinde –SH grubu içeren enzimlere bağlanarak alkil enzim türevi oluşturur

nDiizopropilflorofosfat enzimin serin residuesunun –OH grbundan enzime kovalent olarak bağlanarak, enzimin diizopropil-fosfat türevini oluşturur

nKimotripsin bir serin proteaz

nAktif bölgesinde 195. pozisyonda serin amino asidi bulunur

nEnzim katalitiz mekanizmaları

§Asit-baz katalizi

§Elektrostatik kataliz

§Kovalent kataliz

§Metal iyon katalizi

§Yakınlık etkisi

nGenel asid-baz katalizi

nKimyasal bağlar elektronlar tarafından oluşturulur

nBağların yeniden düzenlenmesi ya da kırılması elektronların hareketini gerektirir

nReaktif kimyasal grupların elektrofil ya da nükleofil gibi fonksiyon gördüğü söylenebilir

nGenel asid-baz katalizi

nElektrofiller, elektron açığı olan maddeler olup, elektron fazlası olan maddelerle reaksiyona girerler

nNükleofiller, elektron fazlası olan maddeler olup, elektron açığı olan maddelerle reaksiyona girerler

nGenel asid-baz katalizi

nPotansiyel olarak reaktif olan bir grubun intrinsik elektrofilik ya da nükleofilik karakterini arttırarak, daha reaktif hale getirilmesi sonucu kataliz gerçekleşebilir

nBu olayı gerçekleştirmenin en kolay yolu bir proton eklenmesi ya da uzaklaştırılması

nGenel asid-baz katalizi

nGenel asid-baz katalizi

nSu intrinsik olarak zayıf bir nükleofil, bir katalist yokluğunda esterle olan reaksiyonu çok yavaş gerçekleşir

nAncak ester hidrolizi yüksek ya da düşük  pH’da çok daha hızlı gerçekleşir

nEnzimlerin aktif bölgelerinde bulunan asidik ya da bazik amino asidlerin varlığı ile asid ya da baz katalizi gerçekleşir

nGenel asid-baz katalizi

nEster ya da amid hidrolizinde bir diğer mekanizma su yerine enzimin aktif bölgesinde daha nükleofilik bir grubun yer alması

nSerin amino asidinin –OH grubu enzimler tarafından bu amaçla kullanılmakta

nAsetoasetat dekarboksilaz enzimi

nElektrostatik kataliz

§Enzimlerin aktif bölgesinde yüklü grupların bulunması elektrostatik etkileşimlerin oluşmasını sağlar

§Substratın bağlanması genellikle enzimin aktif bölgesinden suyu uzaklaştırır

§Daha polar bir yapıya  kavuşan aktif bölge, sulu ortamdakinden daha güçlü elektrostatik etkileşimler geliştirir

nKovalent kataliz

§Enzim üzerindeki nükleofilik bir grup ile substrat üzerindeki elektrofilik bir grup arasında kovalent bağ oluşumu ile kataliz gelişir

nMetal iyon katalizi

§Enzimlerin yaklaşık üçte biri katalitik aktiviteleri için metal iyonlarına ihtiyaç duyar

§Metal iyonları

§Substratları bağlayarak,

§Elektrostatik olarak negatif yükleri stabilize ederek ve koruyarak,

§Oksidasyon-redüksiyon reaksiyonlarına, metal iyonunun geri dönüşümlü oksidasyon değişiklikleri yoluyla aracılık ederek katalitik sürece katılır

nYakınlık etkisi

nBir enzim uygun bir oryantasyonda iki reaktanı bir araya getirerek, reaksiyonu başlatabilir

nÖzellikle bir molekülde gruplar arasında gelişen intramoleküler reaksiyonlar, iki ayrı substratın bir araya gelmesi ile oluşan reaksiyonlardan daha hızlı olarak gerçekleşir

nYakınlık etkisi

nMoleküller arası reaksiyonları katalizleyen enzimler aktif bölgelerine substratlarını bağlayarak, bu substratlar arasında yakınlık oluşturup, reaksiyona uygun oryantasyonu sağlamış olurlar

nSubstratlar bu şekilde bağlandıktan sonra, sanki tek bir molekül üzerindeki intramoleküler bir olay gibi reaksiyon gerçekleşir

  Aşağıdakilerden hangisi reaksiyon hızını etkilemez?

a)Ortam ısısı

b)Ortam pH’sı

c)Substrat özgünlüğü

d)Enzim konsantrasyonu

e)Substrat konsnatrasyonu

Enzim Kinetiği

•Enzim Kinetiği
Tepkimenin hızını bir çok faktör etkiler:
•Kimyasal kinetik (kinetik-çarpışma teorisi) iki kilit kavrama dayanır:
•1.Sadece çarpışan, yanı birbirlerine bağ oluşturma mesafesine kadar yaklaşan moleküller tepkimeye girebilir.
•2. Her kimyasal tepkime için bir enerji engeli bulunur, tepkimenin olabilmesi için bu engelin aşılması zorunludur.
•Başka bir değişle
•a. Reaksiyona giren moleküllerin kinetik enerjilerini artıran
•b. Tepkimenin enerji engelini düşüren
•C. Çarpışma sıklığını artıran etkenler reaksiyon hızını artırması gerekir.
•Sıcaklık
•Sıcaklığin artırılması moleküllerin hem kinetik enerjisini hemde çarpışma sıklığını artırarak tepkimeye giren molekül sayısını artırır.
•Ancak tepkime hızındaki bu artış sonsuza kadar sürdürülemez, zira sıcaklık eninde sonunda substratların artık karlı halde bulunamayacakları belli bir noktya ulaşır.
•Bu sınırlayıcı sıcaklık inorganik moleküller için son derece yüksek olma eğiliminde iken, çoğu organik moleküller için orta derecede, ancak biyolojik tepkimeler için 100oC ‘ın altındadır.
•Enzim konsantrasyonu
•Yüksek reaktant konsantrasyonunda ;
•Hem tepkime için yeterli enerjiye sahip moleküllerin sayısı
•Hemde bunların çarpışma sıklıkları yüksektir. Bu moleküllerin tümü veya bir kısmı tepkime için yeterli enerjiye sahip olduğu zaman geçerlidir
•A ve B gibi iki farklı molekülü içeren tepkimeleri ele alalım:
• A + B ® AB
•A ve B nin derişiminin bir kat artması tepkime hızını bir kat artırır.
•Hem A hem de B derişiminin bir kat artması ise çarpışma olasılığını dort kat artırır. Dolayısıyla reaksiyon hızı 4 kat artar.
•Reaksiyon hızı, reaksiyona giren moleküllerin konsantrasyonu ile orantılıdır
Hız µ[reaksiyona giren moleküller] veya Hız µ [A] [B] Başka bir durum için
A + 2B ® AB2
Hız œ [A] [B] [B] Veya Hız œ [A] [B] 2
•Genel bir ifade ile n sayıda A molekülü m sayıda B molekülü ile reaksiyona girdiğinde
•nA + mB ® AnBm
•Hız œ [A]n [B]m olur.
•Keq hız sabitlerinin oranıdır:
•Kimyasal reaksiyonları çoğu geri dönüşümlü olduklarından n molekül A ile m molekül B den AnBm ‘in oluşturduğu bir tepkime için
•AnBm ® nA + mB
•Uygun hız ifadesi ise Hız œ [AnBm] •Geri dönüşümlü reaksiyon da ise
•nA + mB « AnBm
•Bu ifade şu şekilde okunur: “ n molekül A ve m molekül B , AnBm ile dengededir”.
•İncelenen tepkime için denge sabiti k kullanıldlğında œ sembolu yerine = simgesi kullanılabilir
•Genel bir durum için
•nA+ mB « AnBm
•İleriye (hız1) ve geriye (hız-1)yönelik tepkimelerin hızları şu şekilde gösterilebilir:
•Hız1= k1[A]n [B]m
ve Hız-1= k -1[AnBm] İleri ve geriye yönelik reaksiyonların hızları birbirine eşit olduğunda, sistemin dengede olduğu söylenir, yani
• Hız1 = Hız-1
•Dolaysıyla k1[A]n [B]m = k -1[AnBm] •Ve
• k1 [AnBm] • Keq (denge sabiti)
• k –1 [A]n [B]m
•Dengeki bir sistemin aşağıdaki önemli özellikleri akılda tutulmalıdır:
•1.denge sabiti , tepkime hız sabitleri olan k1/k-1 oranıdır
•2. Dengedeyken öne ve geriye olan reaksiyonların hızları(hız sabitleri değil) eşittir
•3.Denge , dinamik bir durumdur. Dengedeyken reaktant veya ürün konsantrasyonunda net değişiklik olmamasına karşın A ve B sürekli AnBm’e çevrilmekte (bunun tersi de geçerlidir).
•4. Denge halindeyken A ve B ve AnBm konsantrasyonları biliniyorsa, denge sabiti sayısal bir değerle ifade edilebilir.
•ΔGo, Keq’dan hesaplanabilir
•Denge sabiti, ΔGo ile aşağıdaki ilişkiyi gösterir
•ΔGo = -RTlnKeq R, gaz sabiti T= mutlak sıcaklık
•Denge sabiti 1 den büyükse reaksiyon kendiliğinden(spotan) oluşur, yani soldan sağa olan reaksiyon favoridir.
•Denge sabiti 1 den küçükse bunun tersi geçerlidir.
•Bir tepkimenin denge sabiti, bu tepkimenin kendiliğinden gerçekleşip gerçekleşmediğini göstermesine karşın, bu tepkimenin hızla gerçekleşip gerçekleşmediğini göstermez, yani o tepkime için geçerli olan enerji engelinin niteliği hakkında bilgi vermez.
•Bunun nedeni,keq’in ΔGo’yi belirlemede sadece başlangıç ve bitiş hallerini dikkate almasıdır
•Tepkime hızları, ΔGo’nin niceliği yerine enerji engelinin niceliğine bağımlıdır.
•Enzimle katalize edilen reaksiyonların hızını çok sayıda faktör etkiler:
•Sıcaklık:
•Sıcaklık artarken enzimle katalize edilen bir reaksiyonun hızı da artmakla birlikte bu artış sadece dar sınırlar içinde görülür.
•Reaksiyonun hızı başlangıçta sıcaklık artışı ile orantılı olarak artar ve bu olayın nedeni reaksiyona giren moleküllerin kinetik enerjilerin-deki artıştan dolayıdır.
•Ancak enzimdeki bu kinetik enerji artışı, enzimin ikinci-üçüncü yapısını sürdüren zayıf hidrojen ve hidrofobik bağları yıkacak enerji engelini aşar.
•Bu sıcaklıkta , denatürasyona bağlı olarak katalitik aktivite kayıp olur.
•Sıcaklıkta 10oC lık bir artışın biyolojik bir olayın hızında yaptığı artış faktörüne Q10 veya sıcaklık katsayısı denir.
•Birçok biyolojik olayın hızı,sıcaklıkta 10oClik bir artış olduğunda yaklaşık iki kat artar(Q10=2).
•İnsan gibi homeotermik organizmalar beden sıcaklığının ancak çok dar aralıklar içinde değişimine dayanabilir. Dolayısıyla insanda sıcaklıktaki bir değişikliğe bağlı olarak reaksiyon hızında değişiklik olması, ateş veya hipotermi dışında kısıtlı bir öneme sahiptir.
•Reaksiyona ait enerji engelini aşabilmede gereken yeterli kinetik enerjiye sahip moleküllerin sayısındaki artış homeotermik organizmalar için çok kısıtlı bir seçeneği oluşturduğundan bunlarda enzimler reaksiyon hızını nasıl artıracaktır?
•Yanıt:
•Enzimler reaksiyona ait enerji engelini düşürme ve reaksiyon giren moleküllerin konsantrasyonlarını artırma becerilerinde yatar.
•Çoğu enzim içim en uygun sıcaklık, içinde enzimlerin yer aldığı hücrelere ait en uygun sıcaklık ve bunun üzeridir. Ör. Doğal sıcak su kaynaklarında yaşamaya uyum sağlamış mikroorganizmalarda en uygun sıcaklık suyun kaynama noktasına yakın olabilir.
•pH:
•Enzimler için en uygun etkinliğin tipik olarak pH 5 ve9 arasında yer aldığı gözlenmıştır. Öte yandan birkaç enzim(ör. Pepsin) bu sınırın öldukça dışında kalan pH değerlerinde etkilidir.
•pH etkinlik eğrisinin biçimi aşağıdaki faktörler tarafından belirlenir:
•1. Yüksek veya düşük pH’da enzimin denatüre olması
•2. Enzim veya substratların yüklü hallerinde değişiklik olması. pH, substrat bağlama veya katalizde görev yapan bir artığın(kalıntının) yük ve yapısında değişiklik yaparak etkinliği değiştirebilir.
•Bunun göstermek için eksi yüklü bir enzimin(Enz-) artı yüklü bir substrat ile(SH) reaksiyona girdiğini var sayalım:
•Enz SH ® EnzSH
•Düşük pH’da enz- proton alır ve eksi yükünü yitirir:
•Enz- H+ ® EnzH
•Yüksek pH’da SH iyonize olur ve artı yükünü yitirir:
•SH ® S + H+
•Verilen bu örnekte tanım olarak sadece SH ve Enz- birbiriyle etkileşeceğinden uc pH de değerleri, Enz- ve SH+!ın etkin derişimlerini düşürür ve böylece tepkime hızını azaltır
•pH değiştiğinde enzimler konformasyon değiştiğine uğrayabilir. Etkin üçüncü veya dördüncü yapının devamı için substratın bağlı olduğu bölgenin ardında yüklü bir grup gerekebilir. Bu grubun yükünde değişiklik olurken protein çözülebilir, daha katı bir hal alabilir veya protomerlerine ayrılabilir.
•Bunların tümü etkinlik kaybına yol açabilir.
•Zaman(reaksiyon süresi)
•Enzimle katalize edilen reaksiyon hızı zamanla azalır. Bunun nedeni: reaksiyon ürünleri kendi aralarında birleşerek ters yöndeki bir reaksiyonu meydana getirmeleri, enzimin zamanla inaktive olması, reaksiyonu önleyen maddelerin oluşması ve nihayet substratın tükenmesidir.
•Işık ve diğer fiziksel faktörler:
•Enzim aktivitesini artırır veya azaltır. Kırmızı ve mavi ışık, tükürük amilazı ve diğer bazı enzimlerin aktivitelerini artırır. Ultraviyole ise azaltıcı etkiye sahiptir.
•Reaksiyon dereceleriBelirli bir
•miktardaki enzimin reasiyon hızı başlangıç substrat konsantrasyonuna bağlı olarak artmaktadır. Başlangıçtaki bu ilişki doğrusal olarak devam ederken, daha sonra hiperbolik bir şekil almaktadır.
•Lineer fazın başlangıcında enzim birinci dereceden bir kinetik gösterir. Hiperbol fazında bir platoya erişilmekte ve reaksiyon hızı değişmeden devam etmektedir. Enzim reaksiyonu bu durumda sıfırınci dereceden bir kinetik göstermektedir.
•Enzimin tekrar en uygun pH’ya geri getirildiğinde etkinlik, bu değişikliklerin şiddetine bağlı olarak geri dönebileceği gibi geri dönmeyebilir de.
•ENZİMLERLER DENGE SABİTLERİNE ETKİMEZLER:
• enzimler, daha sonra p gibi bir ürün ve serbest enzim vermek üzere bozunan bir enzim-substrst kompleksi(EnzS) yapmak üzere substratla bağlanan bir moleküldür.Bu olay en sade şekilde şöyle gösterilebilir:
• k1
•Enz + S « Enz +p
• k-1
•İleriye , geriye doğru ve reasiyonun tümüne ait hız ifadeleri (Enz) deyimini ortak olarak içerir
• k1
•Enz + S « Enz +p
• k-1
• Hız1 =K1(Enz)(S)
•Hız-1 = (Enz)(P)
•Genel denge sabitine ait ifadede (Enz) değimi ihmal edilebilir:
• k1 (Enz)(P) (P)
•Keq = = =
• k-1 (Enz)(S) (S)
•Yani , enzim derişiminin denge sabiti üzerine hiçbir etkisi yoktur.Bir diğer değiyişle, enzimler hızları etkileyip hız sabitlerini etkilemediğinden bir hız sabitler oranı olan Keq i etkilemezler.
•Başlangıç hızı enzim derişimleri ile orantılıdır:
•Bir reaksiyonun başlangıç hızı , ters reaksiyonun oluşumuna izin verecek yeterli düzeyde ürün oluşmadan önce ölçülen hızdır. Enzimle katalize edilen bir reaksiyonun başlangiç hızı daima enzim derişimi ile orantılıdır. Ancak dikkat edilecek husus bu ifadenin sadece başlangiç hızı için geçerli olduğudur.
•Substrat derişimi reaksiyon hızını etkiler
•Ders anlatımında, enzim reaksiyonları sanki tek bir substrat ve tek bir ürüne sahipmiş gibi ele alınır. Bu durum enzimle bazı reaksiyonlarda görülmesine karşın enzimle kataliz edilen reaksiyonların çoğu iki veya daha fazla sayıda substrat ve ürüne sahiptir.
•Diğer tüm koşullar sabit tutulurken(S) substrat derişimi artırırılacak olursa, ölçülen başlangiç hızı vi(pek az substrat tepkimeye girmişken ölçülen hız) maksimum bir hıza(vmax)a kadar yükselir ve artık daha fazla artış göstermez.
•Substrat derişimi artarken hız da belli bir noktaya kadar artış gösterir ve bu noktada artık enzimin substratla doyduğu söylenir.
•Ölçülen başlangıç hız, maksimum bir değere ulaşır ve substratın enzime göre çok büyük bir molar derişiminde bulunmasından ötürü substrat derişiminde yapılan ek artışlardan etkilenmez.
•Ör M.A. 100 bin olan bir enzim, M.A 100 olan bir substrat üzerine etki yapar ve ikiside 1 mg/ml derişiminde bulnursa her mol enzim başına bir mol substrat var demektir.
•(Enz)=0.1μg/ml=10-9 mol
•(S) =0.1 mg/ml=10-3
•BU durum , enzime göre substratta 106 molar bir fazlalık sağlar.(S) 100 kat düşürülürse bile hala enzime göre 10.000 kat daha büyük bir molar fazlalığa sahiptir.
•Şekilde A ve B noktalarında , enzime oranla çok daha fazla miktarda substrat moleküllerinin bulunmasına karşın ortamdaki enzimin sadece bir bölümü substratla bağlanır.Bunun nedeni Enz +S EnzS reaksiyonuna ait denge sabitinin sonsuz büyüklükte olmayışıdır.
•A ve B noktalarında, (S) daki artış veya azalış S ile EnzS şeklinde birleşen Enz miktarını artırır veya azaltır ve dolayısıyla vi, (S)’e bağımlı olacaktır.
•C noktasında, enzimin hemen tümü substratla birleşmiş olduğundan(S)’de ek artış yapılması, reaksiyona girecek serbest enzim bulunmadığın-dan reaksiyon hızında herhangi bir artışa neden olmaz.
• B noktası, büyük kuramsal ilgi çeken bir hali özetlemekte olup burada enzim moleküllerinin tam yarısı substratla doymuş haldedir. Dolayısıyla burada ölçülen hız, o özel enzim derişimi için ulaşılabilecek maksimum hızın yarsı(Vmax/2) olur.
•Michaelis-Menten Eşitliği
•Mikaelis –Menten sabitinin, Km değeri ile gösterilen ve maksimum hızın yarısına neden olan substrat derişimi, Vi’i (s) ‘in bir fonksiyonu olarak grafik haline getirerek deneysel yoldan belirlenebilir. Km’in boyutu molar derişimdir.
•(S), Km’e yaklaşık eşit olduğunda Vi (S)’deki değişikliklere çok duyarlı olup enzim yarı maksimum hızda çalışır.
•Gerçekte, birçok enzimin Km değeri bunların substratlarının fizyolojik derişimlerine yaklaşık eşittir.
•Michaelis-Menten Eşitliği:
• Vmax (S)
•Vi =
• Km + (S)
•Substrat derişimi değişikliğe uğradığında, birçok enzimin nasıl davrandığını açıklar.
•Enzimle katalize edilen bir reaksiyonun
•başlangıç hızının, (S) ve Km’e bağımlı oluşu, Michaelis-Menten eşitliğinin aşağıdaki şekilde örneklenebilir:
•(1) Km’e göre (S) çok küçük iken (A noktası).
•Km’e (S) eklenmesi paydanın değerinde pek az değişiklik yapacağından (S) ihmal edilebilir. Vmax ve Km’in ikisi de değişmez olduğundan bunların oranı K gibi yeni bir sabitle gösterebiliriz
• Vmax (S) Vmax (S) Vmax
Vi= ;Vi@ @ (S)
• Km+ (S) Km Km
•@K(S)
•Bir diğer değişle, substrat derişimi maksimum yarısı kadar bir hız eldesl için gereken substrat derişiminin (Km) önemli ölçüde altında ise Vi’i başlangıç hızı substrat derişimi olan (S)’e bağımlı olur.
(2) Km’e göre (S) çok büyük iken(c noktası):
Paydadaki (S)’e şimdi Km eklenmesi bunun değerinde pek az değişiklik yapacağından Km ihmal edilebilir:
• Vmax (S) Vmax(S)
•Vi = ; Vi @ @ Vmax
• Km + (S) (S)
•Bunun anlamı,substrat derişimi olan(S), Km’i fazlasıyla aştığında Vi başlangıç hızı maksimumdur (Vmax) dir
•(3) (S)=Km olduğunda(B noktası)
• Vmax(S) Vmax(S) Vmax(S)
Vi = ; Vi= =
• Km (S) (S) +(S) 2(S)
• Vmax
•=
• 2
•Buna göre, substrat derişimi Km değerine eşit olduğunda Vi, başlangıç hızı, maksimum hızın yarısı olur.
•Bu ifade Km’in deneysel olarak nasıl belirleneceğini de söyler.
•Km ve Vmax belirlemede Michaelis-Menten eşitliğinin doğrusal bir biçimi kullanılır.
•Km ve reaksiyon derecesi:
•Substrat konsantarsyonu. Km’den çok küçükse reaksiyon hızı substrat konsantarsyonu İle kabaca orantılıdır. Bu durumda reaksiyon hızının substrata göre birinci basmaktır
•Substrat kons. Km’den büyükse, hız sabit olur ve Vmax / 2e eşittir. Bu durumda reaksiyon hızı substrat konsantrasyonundan bağımsızdır ve reaksiyon sıfırıncı basamaktır.
•Birçok enzim, Vi,(S)’e karşı grafik haline getirildiğinde Vmax’ın (yani Km)’in kolayca hesaplanmasına izin vermeyen doyma eğrileri sağladığından Km ve Vmax un eldesini sadeleştirmek için Michaelis-Menten eşitliğini aşağıda gösterildiği şekilde ters çevirip faktör haline getirilebilir:
• Vmax (S)
Vi =
Km + (S)
Eşitliği ters çevirelim
1 Km + (S)
=
Vi Vmax (S)

•Faktör haline getirelim
•1 Km 1 (S)
• = x +
•Vi Vmax (S) Vmax (S)
•Sadeleştirelim
•1 Km 1 1
• = x +
•Vi Vmax (S) Vmax
•Bu bir doğruya ait eşitliktir
•Y = a . X + b
•Bu eşitlikte
• 1 1
Y = ve x = dir.
• Vi (S)
•Y veya 1/Vi, x veya 1/(S)’in fonksiyonu olarak grafik haline getirilirse y’nin kesim noktası olan b, 1/vmax, eğim yani a, Km/Vmax olur.

•Y=0 yapılarak x ekseninin eksi kesim noktası hesaplanır Böylece
•X= – b/a =- 1/Km
•Böyle bir eğriye çift resiprok eğri denir; yani Vi’nin resiproku(1/Vi), (S)’nin resiprokuna (1/(S))karşı çizilmiştir..
•Km, eğrinin eğimi ve y eksenini kesim noktası veya x ekseninin eksi kesim noktası kullanılarak çift resiprok veya Lineweaver-Burk eğrisinden hesaplanabilir
•Çift resiprok işlem Km’in belirlenmesi için görece birkaç nokta gerektirir ve Km’in saptanmasında en fazla kullanılan yöntemdir.
•Km değeri oldukça yararlı, pratik değere sahiptir. Km’nin 100 katı bir substrat derişiminde bir enzim hemen hemen maksimum hızda etki gösteriri ve dolayısyla maksimum hız(Vmax) var olan etkin enzim mıktarını yansıtacaktır
•Km değerleri bize Vmax’ i ölçmek için ne kadar substrat kullanmamız gerektiğini söyler.
•Çift resiprok işlemin de enzim inhibitörlerinin değerlenmesinde yaygın bir kullanımı vardır.
•Km , enzimin substratına olan ilgisini yansıtmaktadır.
•Km’in büyüklüğü ile bu ilgi arasında ters bir ilişki var. Yani Km ne kadar büyük olursa enzimin ilgisi o kadar az olur.(bunun tersi de doğrudur).
•Enzim İnhibisyonu
•Enzim inhibitörleri katalizi etkileyen (reaksiyonu yavaşlatan veya durduran ) maddelerdir.
•Enzimler birçok seluler prosesi etkilemektedir. Olayısıyla enzim inhibitörleri bilinen en önemli farmasötik ajanlar arasında saymak mümkündür. Ör. Aspirin(asetil salisilik asit) prostaglandinleri (AĞRI OLUŞUMU GİBİ BİRÇOK OLAYDA ETKİLİDİR) SENTEZİNİN İLK BASAMAĞINI İNHİBE ETMEKTEDİR
•Aspirin
• Siklooksijenaz
• aspirin(-)
•Araşidonat « PGG2 PGH2—–
• Cox
•Serin-OH
•Cox + asetil salisilat ® serin-O-asetil+salisi-lat (inaktif)
•Benzer şekilde ibuprofen birinci basamak ile ilgili substrat veya ara ürünleri taklit ederek inhibisyon etkisi yapabilir.
•İnhibisyonun incelenmesi ayrıca enzim mekanizmaları ve metabolik yollar hakında bilgiler sağlar.
•Biyokimyada enzim inhibisyonları birkaç gruba ayrılarak incelenebilir.
•İnhibitörler
•1. Tersinmez (irreversibl) inhibisyonlar
•2. Tersinir(reversibl) inhibisyonlar
•Tersinmez inhibisyon:
•İnhibitör enzimin aktif bölgesine kovalent olarak bağlanır.
•Enzimin protein yapısında bozulma meydana gelir.Or. Enzimin aktif bölge serin amino asitleri ile fosforlu organik bileşiklerin bağlanması .
•Bu bileşiklerin en iyi bileneni(kimyasal savaş ajanı olarak geliştirilmiştir) diizopropil florofosfattir(DFP).
•DFP , aktif merkezinde serin içeren asetil kolin esteraz’ın çok güçlü bir inhibitörüdür.
•Bu enzim bir nörotransmitter olan asetil kolini hidrolize eder. Asetil kolin esteraz’ın inhibisyonu pulmoner sistemde şiddetli spazm neden olur, normal nöromukuler ve kardiyak fonksiyonu bozar.
•Benzer ajanlar tarımda insektisit(böcek öldürücü) olarak kullanılr (bunlar insanlar için öldürücü toksik maddelerdir).
•Ayrıca bir çok enzimin aktivitesi ağır metallerle sıkı kovalent bağ oluşturan sülfidril gruplarına bağlıdır.
•Bu nedenle Hg, pb,Ag ve diğer metaller çok toksiktir.
•Hatta Fe ve Cu gibi esansiyel mineraller bile aşırı alındıklarında entoksikasyona (zehirlenmelere) neden olabilirler
•Reversibl inhibisyonlar:
• Kompetetif(yarışmalı)
• Unkompetetif
• Nonkompetetif inhibisyonlar ayrılabilir.
•Kompetetif inhibisyonlar:
•Yaygın bir inhibisyon türüdür
•kompetetif inhibitör, enzimin aktif bölgesi için substratla yarışırlar. İnhibitör, aktif bölgeyi işgal ettiğinde, substratın enzime bağlanması engellenmektedir.
•Kompetetif inhibitörler, genellikle substratta benzerlik gösteririler ve Enzim- inhibitör(El) kompleksini oluşturmak üzere enzimle birleşirler, ancak bu birleşme katalizle sonuçlanmaz.
•İnhibitör molekülünün geometrisinin bilinmesi sayesinde normal substratın hangi parçasının aktif bölgeye bağlandığı hakkında fıkır edinilebilir.
•Substrat derişiminin artırılması inhibisyonu engeller ve inhibitör varlığındaki Vmax, inhibitör yokluğundaki ile aynı olacaktır.
•Substrat ve inhibitör derişimleri kiyaslanabilir olduğu durumlarda, substat için Km büyüyecektir.
•Burada artan inhibitör derişimi ile doğrunun eğimi değişir, ancak 1/v ekseni üzerinde bulunan 1/max kesim noktası aynı kalır
•Ör. Suksinat dehidrogenaz için malonat bir kompetetif inhibitördür. Çünkü malonat, enzimin substratı olan suksinata yapı olark benzerlik gösterir•
• Suksinat dehidrogenaz
•Suksinat + FAD ® Fumarat + FADH2
•İnhibisyon sonucu, ara metabolizmada oldukça önemli bir metabolik döngünün (krebs döngüsünün) inhibisyonudur.
•Krebs döngüsü benzer şekilde sitratın kompetetif inhibitörü olan florositrat tarafından etkilenir.
•Sitozin arabinozit ve 5-florodeoksiuridin gibi kanser kemoterapisinde kullanılan birçok ilaç nükleik asitlerin biyosentezinin kompetetif inhibitörleridir.
•Aktif bölge için kompetisyona dayalı birçok medikal tedavi örnekleri vardır
•Ör. Metanol zehirlenmesi, etilen glikol zehirlenmesi
•Bu örnekler Alkol dehidrogenaz inhibisyonu ile ilgilidir.
•Kompetetif bir inhibitör olarak etanol, etilen glikol zehirlenmesinin tedavisinde kullanılır.
•Etilen glikol; otomobil antifirizinin önemli bir yapısı(ingesyon ile; 50ölüm/yıl)
•Etilen glikoun kendisi toksik değil, ancak zarar oksidasyon ürünü olan oksalik asitten meydana gelir
•Oksalik asit kristaller böbreklerde birikir.
• Alkol dehidrogenaz
•Etilen glikol ® Aset aldehid
• Bu reaksiyon etkin olarak, etanolun uygun dozunda durdurulabilir. Etkinin esası etanolun bir substrat gibi reaksiyona girmesi ve dolayısıyla etilen glikolun aldehide oksitlenmesinin önlenmesi
•Etilen glikol zararsız olarak ekskrete edilir.

•Etanol ayrıca yarışan bir inhibitör olarak metanol zehirlenmesinin tedavisinde kullanılabilir.(metaol , bir karaciğer enzimi olan alkol dihidrogenaz ile formaldehide (birçok doku için zararlıdir). Körlük metanol ingesyonun enyaygın sonucu körlüktür; çünkü göz formaldehidin zarralı etkisine duyarlıdır.
•Etilen glikol Aset aldehid oksalik asit böbrek taşı
•Unkompetetif inhibisyon:
İnhibitör aktif bölgenin dışında bir yere bağlıdır ve kompetetif inhibitörden farklı olarak inhibitör yalnız ES kompleksine bağlanır.
İnhibitör, ES’ye bağlandığından hem Km hem de Vmax değişir. Linewever-burke çizimleri, farklı inhibitör derişimleri için birbirine paralel doğrular oluşturur.
Bu tür inhibisyon tek substratlı tepkimelerde seyrek, çok substratlı tepkimelerde ise daha sık görülür.
•Non kompetetif inhibisyonlar:
•İnhibitör aktif bölge dışında bir yere bağlanır , ancak inhibitör serbest enzime ya da ES kompleksine bağlanır. Bu durumda substrat için km değişmez ancak Vmax değeri değişir(düşer).
•İlaç olarak enzim inhibitörleri:
•Penicilin ve Amoxicilin(antibiyotikler) bakteriş hücre duvarını sentezleyen enzimleri inhibe eder
•Aspirin: prostaglandin (ağrya neden olan) sentezinin ilk basamağını inhibe eder
•ACE inhibitörleri(Anjiotensin konverting Enzim): captopril, enapril ve lizinopril)
• ACE
•Anjiotensin l ® Anjiotensin ll
•(vozodilatasyon) (vazokontriksiyon)
• ß
• Hipertansiyon
•Kan kolesterol düzeyini düşüren ilaçlar:
•Kolesterol sentezindeki hidroksi metil glutaril –KoA (HMG-KoA) redüktaz yapısal analogları ile kompetetif olarak inhibe edilir(statin grubu ilaçlar- lovastatin, simvastatin, pravastatin, …..)
•Statinler, HMG-KoA redüktazı çok düşük konsantrasyonda(1 mikromol) Halkuki HMG-Koa ‘nin Km değeri 10 mikromoldur.
•Bu ilaçlar koner kalp hastalıkları ve inme tedavisinde kullanılaktadır.
•Ayrıca bu inhibitörler , labortavar testlerinin gerçekleştirilmedimde kullanılan ayıraçlarda da kullanılır. Ör. Asit fosfataz tayınında tartarat maddesi bir inhibitör olarak kullanılır. Bu enzim; karaciğer, böbrek, eritrosit, dalak kemik ve prostatta bulunmaktadır.
•Tartarat, %95 oranında prostat kaynaklı enzimi inhibe ettiğinden, özellikle bu dokuya spesifik prostatla ilgili hastalıkların değerlendirilmesinde kullanılır.
•Prostetik Acp=Total ACP-Non prostetik ACP
•Katalizde etkili olan bazı mekanizmalar
•Asit-baz katalizi
•Kovalent kataliz
•Metal katalizi
•Asit-baz katalizi:Substrat bir kez katalitik noktaya bağlandığında, civardaki aminoaçil kalıtlarının yan zincirlerindeki yüklü(veya yüklenebilen) fonksiyonel gruplar, asidik veya bazik katalizörler olarak fonksiyon görerek kataliz olayına katkıda bulunurlar.
•Asit-baz katalizinde amino asitler:
•Amino asit kalıntıları asit oluşturucular baz oluşturucular
• (proton verici) (proton alıcı)
•Glu, Asp R-COOH R-COO-
• ..
•Lys, Arg R-NH3+ R-N-H2
•Cys R-SH R-S-
•Serin R-OH R-O-
•Kovalent kataliz:
•Bu tip katalizde, enzim ve substrat arasında geçici kovalent bir bağ oluşur. A ve B arasındaki bağın hidrolizini ele alalım.
• H2O
•A-B + X: A-x + B A+ x + B
•Metal katalizi:
•Tüm enzimlerin %25’ten fazlası sıkıca bağlanmış metal iyonlarını içerir veya etkinlikleri için bunlara gereksinim duyar.
•Metalloenzimler, tüm arıtma işlemleri boyunca korunan fonksiyonel bir metal iyonu kesin bir miktarda içeririler.
•Metal ile etkinleşen enzimler, bu metali daha gevşek bağlar, fakat etkinlikleri için metalin eklenmesini gereksinirler.
•Şu halde metalloenzimler ile metalle etkinleşen enzimler arasındaki ayrım, belli bir enzimin o metal iyonuna gösterdiği affiniteye dayalıdır. Her iki durumdaki mekanizma birbirine benzemektedir.
•Metallerle yapılan üçlü kompleksler , katalizde fonksiyon yapar:
•Katalitik nokta(Enz), bir metal iyonu(M) ve substratın(S) stoikiyometrik olarak 1-1-1 oranında yaptığı üçlü komplekslerde 4 şema olasıdır.
• Enz-S-M M-Enz-S
Subs-köprü kompl Enzim-köprü kompl
M
Enz-M-S
Basit metal köpru kompl Enz , S döngüsel metal köprü kompl
•Metalle etkinleştirilen enzimler için bunun dördü de olasıdır. Metalloenzimler, metali tüm aritma işlemleri boyunca korudukları için(yani bunlar önceden EnzM halinde olduklarından) Enz-S-M kompleksi oluşturamazlar. Bu durumda 3 tür genelleme yapılabilir:
•(1) Tümü olmasa da kinazların çoğu(ATP fosfotransferazlar) Enz-nükleosid-M tipi substrat-köprü kompleksi yapar
•(2) Substrat olarak piruvat veya fosfoenol piruvat kullanan fosfotransferazlar, fesfoenol piruvatın diğer reaksiyonlarını kataliz eden enzimler ve karboksilazların metal-köprü komplesksini yapar.
•(3) Belli bir enzim, bir substratla köprü komplekslerinin bir tipini yaparken bir diğer substratla diğer tipini oluşturur.
•A.Enz-köprük kompleksleri(MEnzS):
•Enzim köprü kompleksleri metallerin etkin bir komformasyonu sürdürmek için çatısal roller yüklendiği(Ör.glutamin sentaz) veya bir substrata metal bir köprü attığı (Ör.piruvat kinaz) var sayılır.
•Ayrıca piruvat kinaz bir substratı(ATP) gerekli yerde tutmakta ve bunu etkinleştirmektedir.
•B- Substrat köprü kompleksleri(EnzSM):
•Nukleosid trifosfat enzimi, metal ve substratla üçlü kompleks oluşturması, metalin koordinasyon küresindeki suyun yerine ATP geçmesine bağlanabilir.
•ATP-4 + M(H2O)6+2 « ATP-M(H2O)3-2 +3H2O
•Daha sonra üçlü bir kompleks oluşturmak üzere enzim bağlalanır.
•ATP-M(H2O)3-2 + Enz « Enz-ATP-M(H2O)3-2
•C- Metal köprü kompleksleri:
•Bir çok proteinin(Ör.karboksipepptidaz A, Sitokrom C, methemoglobin) etkin noktasında metal bağlanması ile ilgisi olan bir His kalıtının varlığı gösterilmiştir. İki elamanlı EnzM kompleksi için hız kısıtlayıcı basamak birçok durumda suyun, metal iyonnu koordinasyon küresinden uzaklaşmasıdır.
•Enz + M(H2O)6 « Enz-M(H2O)6-n + nH2O
•Öte yandan metalloenzimler için substratın(s) ikili EnzM kompleksi ile birleşerek üçlü metal kompleksi yapması zorunludur.
•Metal iyonlar katalizde çok sayıda fonksiyon üstlenirler:
•Metal iyonları; enzimlerin , kimyasal reaksiyonların hızını artırmada kullandığı bilinen 4 mekanizmadan birine katılabilir.
•1. Genel asit-baz katalizi
•2. Kovalan kataliz
•3. Reaksiyona girenlerin birbirlerine yaklaştırılması
•4. Enzim veya substratta uyarılmayı kamçılama
•Metal iyonları tıpkı protonlar gibi lewis asitidir (elektrofillerdir) ve bir sigma bağı yapmak üzere bir elektron çiftini paylaşabilirler.
•Metal iyonları nötral çözeltilerde var olabilmeleri, genellikle 1 den büyük bir + yüke sahip olmaları ve p bağları yapabilmeleri nedeniyle super asitler olarakta kabul edilebilirler.
•Bunlara ek olarak (protonlardan farklı olarak) metaller enzim veya substrat üzerindeki bazik grupların oriyantasyonu için üç boyutlu kalıp hizmeti verebilir.
•Metaller , elektron sağlayarak nükleofilleri etkinleştirebilir veya bizzat nükleofil olarak davranır.
•Bir metalin koordinasyon küresi enzim ve substratı bir araya getirebilir(yakınlaştırma) veya enzim veya substrattan herhangi birisine çelat oluşturan burkulmaya(gerilme)neden olabilir.
•Regülatör Enzimler
•Metabolik işlevlerin kontrolu , enzimatik reaksiyonların düzenlenmesi ile olur.
•- Substrat düzeyinde kontrol:
•Birçok substratın düzeyi Km seviyesinde olduğundan, enzimler substarat konsantrasyonundaki değişikliklere cevap verir
•Ayrıca bu düzenleme , özelleşmiş fonksiyonu olan bazı enzimler tarafından(düzenleyici enzimler) yapılır.
•Bu enzimler;
•-Allosterik etkiyle
•-kovalent modifikasyonla
•Fizyolojik şartlar değiştiğinde enzim sentez hızında değişimler yaparlar.
•Allosterik Enzimler:Aktif bölge dışında bir yere (regülatör bölge) nonkovalant olarak bağlanan effektör(modilatör, modifier) molekül tarafından düzenlenirler.
•Bir allosterik effektör:
-enzimin substrata olan ilgisini değiştirebilir (Km değiştirir)
•-Enzimin maksimal katalitik aktivitesini değiştirebilir(Vmax değiştirir)
-Her iki değişikliği bir den yapabilir.
-Allosterik effektörler(etki yönünden)
– -negatif effektörler
-pozitif effektörler
•Allosterik enzimler; genellikle birden fazla alt birimi vardır(oligomeriktir), çoğunlukla 4 alt birimden oluşur.
•Bunlar genellikle metabolik yolun başlarıbdaki bir anaktar basamağı katalizler.
•Allosterik effektörler:
•1. Substratın kendisi bir effektör görevi yapabilir (homotropik etki).
•Allosterik bir substrat genellikle pozitif bir effektör olarak fonksiyon gösterir.
•Enzimin bir bölgesine bir substrat bağlanması, diğer aktif merkezlerin katalitik özelliklerini uyarır yani bu bölgler kooperativite gösterir.(bu etki hemoglobinin oksijen bağlaması ile benzerlik gösterir.
•Allosterik enzimlerde Vo, (S)’ye karşı grafiklendirildiğinde sigmoidal bir eğri elde edilir.
•2. Effektör substrattan farklı olabilir.; bu etkiye heterotropik etki adı verilir.Ör feedback inhibisyonu
• (-)
•A B C D K
•(k) kons. Artış olması metabolik yolda ilk hız inhibe olur.
• Enzim Allosterik effektör
•Fosfofruktokinaz ……. Fruktoz-6-fosfat(+)
•Piruvat karboksilaz …… Asetil-KoA (+)
•Tronin deaminaz ……. İzolösin(-)
Aspartat Transkarbamilaz…Sitidin trifosfat (-)
•Kovalan Modifikasyonla Düzenleme
•Önemli bir regülasyon şeklidir. Sıklıkla, protein kinaz ya da protein fosfatazlar tarafından katalize edilen fosforilasyon/defosforilasyon olaylarını içeririler. fosforile ve defosforile biçimleri arasındaki dönüşüm
•Bir enzime genellikle onun aktivitesinde önemli değişiklikler yaratır.
•Serin, treonin ve tirozin hidroksilleri fosfat gruplarının eklendiği gruplardır.
•Glukoz metabolizmasında bir enzimin fosforilasyonu glikojen yıkımını uyarırken, bir başkasının fosforilasyonu ,glikojen sentezini inhibe eder.
•Kovalan modifikasyonun enzim düzenlenmesinde özel avantaji var. Enzimin fizyolojik olarak aktif olan biçiminin oranını, peptidin bir kısmının ziyan edilmesi yada peptidin tümünün yenilenmesine gerek kalmadan değiştirerek enerji akışının miktar ve yönünü düzenler. Bu şekilde hızlı ve tersinir kontrolu mümkün kılar.
•Katalitik etkinlikleri fosforlama/fosforsuzlaştırma ile değiştirilen enzim örnekleri
• Etkinlik durumu
•Enzim düşük yüksek
•Asetil-KoA karboksilaz EP E
•Gklikojen sentaz EP E
•Glikojen fosforilaz E EP
•HMG-KoA redüktaz EP E
•EP(fosforlu enzim) E(fosforsuz enzim)
•Kovalan modifikasyonda fosforilasyon/defosforilasyon çok sık görülmekle birlikte bu işlem diğer şekillerde de yapılabilmektedir.;Örneğin
•-Adenilasyon
•-Uridilasyon
•-ADP-ribozilasyon
•-Metilasyon
•Enzim sentezinin indüklenmesi/baskı-lanması:
•Allosterik enzimlerle ve kovalan modifikasyonla; var olan enzim aktivitesi değiştirilebilir.
•Oysa hücreler, var olan enzimin sentez hızını değiştirerek düzenleme fonksiyonunu yapar.
•İnduksiyonla…..sentez artışı olur
•Baskılanma….. Sentez azalması olur
•Bu iki etken ile aktif bölge sayısında değişim olur.
•Bu enzimler gelişimde sadece bir basamakta veya belirli şartlarda gereksinim duyulan enzimlerdir
•Ör. İnsulin, kan glukozunun arttığı durumlarda, glukoz metabolizmasında anahtar durumundaki enzimlerin sentezini artırır.
•Ancak protein sentezini düzenleyen enzimlerin aktivitesi diğer düzenleyici enzimlere göre daha yavaştır, ve bunlar hücrede sürekli kullanılan enzimler değildir.
•Enzim regülasyonu ile ilgili mekanizmalar farklı farklı sürelerde etkili olur.
•Mekanizma effektör süre
•Substrat varlığı substat hemen
•Alosterik kontrol son ürün hemen
•Kovalan modi- başka bir enzim hemen/dak
•Fikasyon
•Enz.sentez/yıkım hormon/metaboli saatlar/günler

Biyokimya I Ders Notları ( Yrd. Doç. Dr Kudret YILDIRIM )

•BİYOKİMYA I DERS NOTLARI
•Enzimler, Enzim Kinetiği, Enzim İnhibisyonu, Düzenleyici Enzimler ve Enzim Aktivitesinin Düzenlenmesi
•Enzimler
Enzimler canlılardaki reaksiyonları hızlandıran özel proteinlerdir Enzimler yan ürün oluşturmadan %100 verim sağlar Canlılardaki bütün kimyasal olaylar enzimlerce gerçekleştirilir Enzimler biyomoleküllerin hızlı bir şekilde reaksiyona girmesini sağlarlar Günümüzde 2000’den çok daha fazla enzim tanımlanmıştır Bu enzimlerin çoğu saflaştırılıp kinetikleri incelenmiştir 200’den fazla enzim ise kristallendirilmiştir Enzimler geçmişte etkiledikleri substratlarına göre adlandırılmıştır Mesala, üreyi CO2 ve NH3’e parçalayan enzime üreaz adı verilmiştir Arginini, ornitin ve üreye parçalayan enzime ise arginaz adı verilmiştir Aynı yıllarda substratlar hakkında bile bilgi vermeyen isimlerde kullanılmıştır Pepsin, tripsin, kimotripsin, katalaz… Zamanla enzim sayısının artması sistematik bir adlandırmayı mecburi kılmıştır Günümüzde enzimler Uluslararası Enzim Komisyonunca adlandırılır Yinede bir çok biyokimyacı enzimler için hala geleneksel isimleri kullanmaktadır Enzimlerin sistematik isimleri ise genellikle parantez içinde verilmektedir
Sistematik adlandırmanın temel özellikleri aşağıdadır
Reaksiyonlar ve reaksiyonları katalizleyen enzimler aşağıdaki 6 sınıfa ayrılmıştır. Oksidoredüktazlar, transferazlar, hidrolazlar, liyazlar, izomerazlar ve ligazlar Her bir sınıf ise kendi içinde 4-13 alt sınıflara ayrılmıştır Enzim adı 2 kısımda verilir İlk kısımda substrat(lar) verilir Substrat sayısı birden fazlaysa substratlar arasında : konulur İkinci kısımsa reaksiyon tipi hakkındadır ve grup veya alt grup adıdır Adlandırma için reaksiyon tipi sonuna –az eki getirilir Reaksiyon tabiatını açıklayan ifadeler ismin sonunda ve parantez içerisinde verilir Her enzime enzim kodu adı verilen sistematik bir kod verilir Bu kod E.C. harflerinden sonra gelen 4 rakamdan ibarettir (E.C. X.V.Y.Z.) Birinci rakam enzimin dahil olduğu sınıfı verir İkinci rakam enzimin dahil olduğu alt sınıfı verir Üçüncü rakam ise daha alt sınıfını verir Dördüncü rakam ise enzimin aynı ilk 3 rakama sahip enzimler arasındaki sırasını verir Enzim sınıflarını sırası ve örnekleriyle inceleyelim

Oksidoredüktazlar
Oksidoredüktazlar 2 substrat arasındaki redoks reaksiyonlarını katalizler Bu Sınıf dehidrogenazlar, oksidazlar, redüktazlar, oksijenazlar gibi enzimleri içerir “Alkol + NAD+ aldehit (keton) + NADH + H+ ” reaksiyonunu ele alalım Reaksiyonu katalizleyen enzimin geleneksel adı alkol dehidrogenazdır Bu enzimin sistematik adı ise Alkol:NAD+ oksidoredüktazdır Bahsedilen enzim için enzim kodu ise E.C. 1.1.1.1. ile verilmektedir
Transferazlar
Transferazlar belirli grupların 2 substrat arasındaki transferini katalizler H atomlarının 2 substrat arasındaki transferini oksidoredüktazlar katalizler “Asetil CoA + kolin CoA + O-asetil kolin” reaksiyonunu ele alalım Reaksiyonu katalizleyen enzimin geleneksel adı kolin açil transferazdır Enzimin sistematik adı ise Asetil CoA:kolin O-asetil transferaz Bahsedilen enzim için enzim kodu ise E.C. 2.3.1.6. ile verilmektedir
Hidrolazlar
Hidrolazlar, bazı bağların su katılımıyla parçalanmasını katalizler Ester, eter, peptid, glikozid, anhidrit, C-halojenür veya P-N bağları hidrolizlenir “Asetil kolin + H2O asetik asit + kolin ” reaksiyonunu ele alalım Bu reaksiyonu katalizleyen enzimin geleneksel adı asetil kolin esterazdır Enzimin sistematik adı ise asetil kolin asetil-hidrolazdır Enzim için enzim kodu ise E.C. 3.1.1.8. ile verilmektedir
Liyazlar
Liyazlar substratlardan belirli grupların ayrılması ile çift bağ oluşumunu katalizler Bu enzimler ayrıca çift bağlara çeşitli grupları ilave ederler “HCO3 – + H+ H2O + CO2” reaksiyonunu ele alalım Reaksiyonu katalizleyen enzimin geleneksel adı karbonik anhidrazdır Enzimin sistematik adı ise karbonat hidroliyazdır Bahsedilen enzim için enzim kodu ise E.C. 4.2.1.1. ile verilmektedir
İzomerazlar
İzomerazlar çeşitli izomerlerin birbirlerine dönüşümünü katalizler Mutaz, rasemaz, epimeraz gibi isimlerle anılan enzimler bu sınıfa dahildir “D-Gliseraldehit-3-fosfat dihidroksiaseton fosfat ” reaksiyonunu ele alalım Reaksiyonu katalizleyen enzimin geleneksel adı trioz fosfat izomerazdır Enzimin sistematik adı ise D-Gliseraldehit-3-fosfat ketolizomerazdır Enzim için enzim kodu ise E.C. 5.3.1.1. ile verilmektedir
Ligazlar
Ligazlar iki substratın birbirlerine bağlanmasını katalizler Reaksiyon için gereken enerji ATP veya GTP hidrolizinden sağlanır “ATP + L-glutamat + NH4+ ADP + PO4-3 + L-glutamin” reaksiyonunu ele alalım Reaksiyonu katalizleyen enzimin geleneksel adı glutamin sentetazdır Enzimin sistematik adı ise L-glutamat : NH4+ ligaz (ADP) Bahsedilen enzim için enzim kodu ise E.C. 6.3.1.2. ile verilmektedir Bazı enzimler kataliz görevini sadece protein yapıları ile yerine getirir Bazı enzimler ise kataliz için bazı yardımcı faktörlere ihtiyaç duyar Bu yardımcı faktörlere kofaktör adı verilir Kofaktörler metal iyonları veya kompleks bir organik bileşikte olabilir Kompleks organik bileşiklere ayrıca koenzimler adı verilir Katalitik açıdan aktif enzim-kofaktör kompleksine holoenzim adı verilir Kofaktörsüz enzime apoenzim denir Kofaktörsüz proteine ise apoprotein denir Çoğu enzim kofaktör ile sadece kataliz esnasında bir araya gelir Bazı kofaktörler ise enzimin sabit bir bileşenidir Enzimle her daim beraber olan bu kofaktörlere prostetik grup adı verilir Kofaktör olarak görev yapan metal iyonları 2 ayrı fonksiyonu vardır Bu iyonlar S ve E arası kordinasyon kompleksi için bir köprü işlevi görür Metal iyonları bizzat katalitik fonksiyona sahiptir Koenzimler genelde oksidoredüztazlar ve transferazlarla çalışır Elektronlar, belirli atom veya grupların transferinde görev alırlar Koenzimlerin çoğu B grubu gibi suda çözünen vitaminlerin türevleridir
Hayvanlar B grubu vitaminlerini sentezleyemeyip besinlerle hazır alırlar Kataliz için önce substratlar (varsa kofaktörler) enzime bağlanmalıdır Bağlanma aktif bölge denilen enzim üzerindeki özel bölgelerde gerçekleşir Aktif bölgeler özel bazı rezidüler* içeririler Bu rezidüler ile substratlar (varsa kofaktörler) enzimlerine bağlanır Ayrıca bahsedilen rezidüler katalitik aktiviteyi bizzat gerçekleştirebilirler Bundan dolayı bahsedilen rezidülere katalitik gruplar adı da verilir
Protein bünyesine dahil olan amino asitler
Enzimlerin aktif bölgeleri aşağıdaki ortak özelliklere sahiptir Aktif bölgeler enzimin çok küçük bir kısmını oluştururlar Enzim yapısındaki çoğu rezidüler substratla etkileşmez Aktif bölgeler 3 boyutlu bir yapılardır Normalde birbirinden çok uzak olan rezidüler aktif bölgede yan yana gelir Aktif bölgeler substratlara zayıf bağlarla bağlanırlar Ürünün oluşumu ve ayrılabilmesi için bağlanma tersinir olmalıdır Aktif bölgeler bir yarık ve girinti içerisinde yer alırlar Substratlar, suyun girmediği çukur bölgelere bağlanır Bu bölgeler bağlanma ve katalizden sorumlu polar gruplarda içerir Aktif bölgelerin yapısı spesifik bir bağlanmayı gerektirir Substrat enzime bağlanabilmek için özel bir yapıda olmalıdır
Anahtar-kilit modeli (E.H. Fischer)
Bazen ise substrat bağlanması aktif bölgenin şeklini değiştirebilir Etkileşme sonucu uygunluk modeli (D. E. Koshland) Enzimler katalizledikleri reaksiyon tipine oldukça spesifiktirler Genellikle tek bir reaksiyonu veya benzer bazı reaksiyonları katalizler
Enzimlerin substratlarına olan spesifikliği çok yüksek bazen mutlaktır Birçok enzim ayrıca stereospesifiktir Laktat dehidrogenaz sadece L-laktata etkilidir Glutamat dehidrogenaz sadece L-glutamata etkilidir Bazı enzimler ise geniş aralıkta bir spesifiklik gösterirler Mesala fosfatazlar benzer yapıdaki bir çok bileşiğe etkiler Enzimin substrata spesifikliği substratta 2 yapısal özelliğin olmasını gerektirir Substrat enzimin etkileyebileceği bir bağa sahip olmalıdır Substrat üzerinde bazı özel gruplar bulunmalıdır Bu gruplar enzime bağlanarak substratı katalitik bölgeye yaklaştırabilmelidir
•Enzim Kinetiği
Enzim kinetiği enzim reaksiyon hızlarını ve mekanizmalarını inceler Enzim kinetiği kimyasal kinetiğin temel prensiplerine uyar Kimyasal reaksiyonlar etkileşen reaktant sayısına göre sınıflandırılır Monomoleküler, bimoleküler ve termoleküler reaksiyonlar Kimyasal reaksiyonlar reaksiyon mertebelerine göre de sınıflandırılır Reaksiyon mertebesi hızı etkiyen reaktant konsantrasyonu sayısını verir 1° reaksiyonların hızı sadece bir reaktantın konsantrasyonuna bağlıdır Mesala, A P reaksiyonunu ele alalım Reaksiyonun hızı A’nın yok olma hızı veya P’nin oluşma hızıyla orantılıdır Herhangi bir t anındaki hız ifadesi aşağıdaki gibi verilir
V= d[P] / dt = – d[A] / dt = k [A] k hız sabitidir ve sıcaklıkla değişir
k [A] ifadesinin integrali alınıp logaritmada 10 tabanına göre yazılabilir
Bu durumda log [A0] / [A] = k x t / 2,303
[A0], başlangıç konsantrasyonu, [A] ise herhangi bir andaki konsantrasyondur
[A], t > 0 olduğu herhangi bir andaki konsantrasyondur
[A]= 0,5[A0] ise A maddesinin konsantrasyonunun yarıya düştüğünü gösterir
Bu arada geçen süre ise yarılanma süresidir ve t1/2 ile verilir
1° reaksiyonlar için t1/2= 0,693/ k’dir ve t1/2 başlangıç miktarından bağımsızdır
2° reaksiyonların hızı genelde 2 ayrı reaktantın konsantrasyonuna bağlıdır
Hız sadece bir reaktant konsanrasyonunun 2. kuvvetine de bağlı olabilir
Mesala, A + B P ve 2A P reaksiyonlarını ele alalım
İlk reaksiyonun hız ifadesi d[P] / dt = – d[A] / dt = – d[B] / dt = k [A] [B] olur. İkinci reaksiyonun hız ifadesi d[P] / dt = – d[A] / 2dt = k [A]2’ dir
A + B P reaksiyonu her zaman 2. mertebeden olmayabilir
Reaksiyon bazen birinci mertebeden gibi davranabilir
Mesala, [A] >> [B] ise hız sadece [B]’ye bağlıdır ve 1°’dendir
Kısaca reaksiyon mertebesi sadece reaktant sayısından anlaşılamaz
Reaksiyonun gerçekleştiği şartlarda dikkate alınmalıdır 3° reaksiyonlarına nadiren rastlanır Bazı reaksiyonların hızı ise hiçbir reaktanta bağlı değildir Bu tip reaksiyonlar sıfırıncı mertebedendir Çoğu enzim reaksiyonları sıfırıncı mertebedendir A’nın P’ye dönüştürürdüğü bir reaksiyon düşünelim A moleküllerinin P moleküllerine dönüşümü için bir enerji engeli aşılmalıdır Bahsedilen enerji engeline aktifleşme (aktivasyon) enerjisi (ΔG‡) adı verilir Yüksek enerjili (aktifleşmiş) A molekülleri hızla P’ye dönüştürülür Dönüşüm, gerekli bağın oluşumu veya parçalanması ile gerçekleşir Aktifleşme engelinin üst noktasına geçiş hali denir Her kimyasal reaksiyon için bir geçiş hali veya geçiş kompleksi vardır Geçiş hali, etkileşen moleküllerin enerjice zengin hallerini gösterir Bir reaksiyonun hızı geçiş hali konsantrasyonu ile orantılıdır Reaksiyon esnasında sıcaklık artırıldığında moleküllerin enerjisi artar Moleküllerin enerjisinin artması geçiş hali konsantrasyonunu artırır Geçiş hali konsantrasyonunun artışı ise reaksiyon hızını artırır. Katalizör adı verilen bazı maddeler ise aktifleşme engelini düşürür. Katalizörler reaktantlarla daha düşük enerjili geçiş halleri oluşturur Aktifleşme engelinin düşmesi ise reaksiyon hızını artırır Katalizörler reaksiyon hızını artırırken reaksiyon dengesini etkilemezler Katalizörler dengeye daha hızlı erişmeyi sağlar  Katalizörler reaksiyondan değişmeden ayrılır Enzimler protein yapısında olan biyolojik katalizörlerdir Düşük [S] durumunda reaksiyon hızı [S] ile orantılı olarak artar Yani reaksiyon substrata göre birinci mertebedendir [S] artışı ile reaksiyon hızı artışında bir azalma gözlenir Reaksiyon mertebesi ise sıfırıncı ile birinci mertebe arasında bir mertebedendir
[S] artışı daha da artınca hız sabitleşir ve [S] artışı ile hız artmaz Bu durumda reaksiyon sıfırıncı mertebedendir Bu mertebede enzim molekülleri substratlarıyla bir arada yani doymuş haldedir Bütün enzimler sözü edilen doygunluk özelliğini gösterirler Farklı enzimler farklı [S] ile doygunlaşır Enzimler canlılarda çok az miktarlarda bulunur Bu sebebten dolayı enzimlerin miktarları değil aktiviteleri ölçülür Enzim aktivitesi ölçmek için ise enzimin katalizlediği reaksiyonun hızı belirlenir Enzim kinetiği enzimlerin katalizlediği reaksiyonların hızlarını inceler Michaelis ve Menten enzim kinetiğinin ilk öncüleri olmuşlardır Bazı özel kabullerle reaksiyon hızları ile ilgili aşağıdaki eşitlik elde edilir Yukarıdaki eşitlik Michaelis-Menten eşitliği olarak adlandırılır Michaelis-Menten eşitliği aşağıdaki kabullerle açıklanabilir
– Ürün (P)oluşumu öncesi bir enzim substrat kompleksi (ES) oluşumu gerekir – ES kompleksinin ürüne parçalanması en yavaş basamak olarak gerçekleşir Bu basamak enzimin gerçekleştirdiği reaksiyonun hızını belirler ES oluşumu ve ES’nin E ve S’ye ayrışımı çok daha hızlıdır
– Bir substrat molekülü sadece bir enzim molekülüne bağlanabilir
– [S] >>[E] olduğundan reaksiyonun en azından ilk dakikalarında [ES] sabittir
Reaksiyonun ilk dakikalarında hız [ES]’ye bağlıdır İlk 3 kabul Michaelis ve Menten’e aitken son kabul Briges ve Haldene’e aittir 4. kabül sadece enzimatik reaksiyonların ilk dakikaları için geçerlidir S, P’ye dönüştürüldükçe [S] düşer ve 4. kabul geçersizleşir Ayrıca P birikimi reaksiyonuda inhibe edebilir Yukarıdaki ifadede k1, k2 ve k3 hız sabitleridir Son kabule göre [ES] sabitken ES oluşum hızının ES parçalanma hızına eşittir Yani, ES oluşum hızı = ES parçalanma hızı veya k1 [E] [S] = k2 [ES] + k3[ES] olur [ES] + [E] = [Et] olarak alınıp yeni bir düzenleme yapılabilir [E], serbest E konsantrasyonu iken, [Et] ise toplam E konsantrasyonudur [ES] + [E] = [Et] ifadesinden [E] = [Et] – [ES] olarak alınabilir Bu durumda eşitlik k1 ([Et] – [ES]) [S] = k2 [ES] + k3[ES] olur Yukarıdaki ifade ise k1 [Et] [S] – k1[S] [ES] = k2 [ES] + k3[ES] olur k1[Et] [S] – k1[S] [ES] = k2 [ES] + k3[ES] ifadesinde k1 [Et] [S] yalnız bırakılır Yeni eşitlik k1 [Et][S] = k2[ES] + k3[ES] + k1 [S][ES] olur Bu eşitlik ise kısaca k1 [Et] [S] = [ES] (k2 + k3 + k1 [S]) ile verilebilir
[ES] yalnız bırakıldığında aşağıdaki eşitliğe erişilir Yukarıdaki eşitlikteki pay ve payda k1 değerine bölünebilir Yukarıda yeni eşitilikteki (k2 + k3) / k1 ifadesi Km veya Michaelis sabiti olarak bilinir Çoğu enzim için k2 >> k3 olduğundan k3 ihmal edildiğinde Km değeri k2 / k1 olur Km enzimin substratına olan ilgisinin bir ölçüsüdür Km değeri (k2 / k1) büyük olduğunda reaksiyon ES’nin E ve S’ye ayrıştığı yönde gerçekleşir Bu aynı zamanda enzimin substratına olan ilgisinin az olduğunu da gösterir Km değeri küçük olduğunda ise reaksiyon E ve S’den ES oluşumu yönünde gerçekleşir Bu ise enzimin substratına olan ilgisinin fazla olduğunu gösterir
Yukarıdaki eşitlikte (k2 + k3) / k1 yerine Km yerleştirildiğinde ise aşağıdaki gibi değişir Belirtildiği gibi reaksiyonun en yavaş gerçekleşen basamağı ES’nin E ve P’ye dönüşümüdür Bu nedenle reaksiyon için hız ifadesi v = k3[ES] veya v = k3[Et] olur
v = k3[ES] eşitliğindeki [ES] yerine [Et] [S] / [S] + Km ifadesi konulabilir Bu durumda yeni eşitlik aşağıdaki gibi olur Doygun bir [S] ve sabit bir [E] için maksimum ilk hızı Vmax olarak ifade edelim Bu durumda Vmax = k3[ES] veya Vmax = k3[Et] olur Hız denkleminde k3[Et] yerine Vmax yerleştirildiğinde ise Michaelis-Menten eşitliğine ulaşılır Yukarıdaki eşitlik tek substratlı enzimle katalizlenen reaksiyon için ilk hızı verir Eşitliğe göre herhangi bir andaki ilk hız o andaki Km, Vmax ve [S] ile belirlenir Eşitlik aynı zamanda v, Vmax ve [S] arasındaki kantitatif ilişkiyi gösteren bir ifadedir v, Vmax ve [S] birbirlerine kantitatif olarak Km sayesinde ilişkilendirilir Km , konsantrasyon birimleriyle ifade edilen bir parametredir v = Vmax / 2 olduğu bir anda ilk hız eşitliği v = 2v x [S] / (Km + [S]) olur Bu ifade aynı zamanda 2v x [S] = v (Km + [S]) demektir Eşitliğin her iki tarafı v ile bölündüğünde ise Km = [S] olur Kısaca Km, ilk hız Vmax / 2 olduğundaki substrat konsantrasyonudur Bu sebebten dolayı Km’nin konsantrasyon birimleri ile ifadesi normaldir Çoğu enzim için Km değeri 1 µM ile 10 mM arasında değişir Vmax ise genelde µmol ürün / dk / mg enzim olarak ile verilir Vmax ayrıca veya µmol ürün / dk / mol enzim olarak da verilebilir Herhangi bir enzim için Vmax ve Km değerleri deneysel olarak bulunabilir Vmax ve Km , v değerlerine karşı [S] değerleri grafiğinden elde edilebilir v değerlerine karşı [S] değerleri hiperbolik bir eğri verir Grafiğe göre v = Vmax olmayacağından Vmax ve Km değerleri tam bulunamaz Pratikte Vmax ve Km değerlerini elde etmek için daha farklı bir yol izlenir Bu amaçla Michaelis-Menten eşitliği farklı şekillerde bir doğru denklemine çevrilir Mesela Lineweaver-Burk eşitliğini ele alalım Lineweaver-Burk eşitliği Michaelis-Menten eşitliğinden elde edilir Michaelis-Menten eşitliği tersine çevrildiğinde Lineweaver-Burk eşitliği bulunur Eşitliğin y: m x + n ile ifade edilebilecek bir doğru denklemini verdiği görülür y: 1/v, m (eğim): Km /Vmax, x: 1/ [S] ve n ise doğrunun y- eksenini kestiği noktadır 1 / v değerlerine karşı 1 / [S] değerleri ile aşağıdaki grafik elde edilir Yukarıdaki grafiktekten Km ve Vmax değerleri kolayca hesaplanabilir Km ve Vmax değerleri Eadie-Hofstee eşitliği yardımı ile de bulunabilir Eadie-Hofstee eşitliğine Michaelis-Menten eşitliğinden ulaşılabilir Eşitliğin her iki tarafı önce Km + [S] ile çarpılır daha sonra ise [S]’ye bölünür Eadie-Hofstee eşitliği Lineweaver-Burk eşitliğinden de elde edilebilir Bunun için eşitliğin her iki tarafı Vmax ile çarpılıp yeniden düzenlenir Düzenleme sonucunda aşağıdaki Eadie-Hofstee eşitliği elde edilir Eadie-Hofstee eşitliğinin grafiği için v değerlerine karşı v / [S] değerleri alınır Aşağıdaki grafikten Km ve Vmax değerleri hesaplanabilir Km ve Vmax değerleri Hanes-Woolf eşitliği yardımı ile de bulunabilir Hanes-Wolff eşitliği Lineweaver-Burk eşitliğinden elde edilebilir Bunun için eşitliğin her iki tarafı [S] ile çarpılıp yeniden düzenlenir Düzenleme sonucunda aşağıdaki Hanes-Wolff eşitliği elde edilir Şu ana kadar hep tek substratlı bir enzimatik reaksiyondan bahsedildi Halbuki çoğu enzimatik reaksiyonlar birden çok substrat içerir Bu tip reaksiyonlar sonucunda sık sık birden fazla ürün oluşur Çok substratlı reaksiyonların mekanizmaları oldukça karmaşıktır Yinede bu tip reaksiyonların kinetikleri sık sık aşağıdaki eşitlikle verilebilir Eşitlik sadece A konsantrasyonunun değiştiği bir reaksiyon içindir
Diğer substratların konsantrayonu ise sabit kalmalıdır çalışmada elde edilen (gözlenen) Vmax değeridir çalışmada elde edilen (gözlenen) Km değeridir
Dersin bu kısmında ise daha ziyade iki substratlı enzimlerle ilgilenilecektir Hücrelerde gerçekleşen reaksiyonların çoğu iki substratlıdır Enzim için iki substrat olduğunda, basamakların sırası önem kazanır Basamakların sırası enzim mekanizmasını belirler Bu tip reaksiyonlar substrat bağlanma sırasına göre birkaç sınıfa ayrılır Substratların rastgele bağlandığı reaksiyonlar Substratların sırayla bağlandığı reaksiyonlar
Ping-pong reaksiyonları
Rastgele bağlanma gerçekleşirken substratlardan birisi ilk bağlanır Mesala, glukozun ATP ile fosforilasyonu bu tip bir reaksiyondur Reaksiyonu hekzokinaz enzimi gerçekleştirir Sıralı bağlanma gerçekleşirken substratlardan birisi ilk bağlanır Diğer substrat ise daha sonra bağlanır Bu tip reaksiyonlara bazı bileşiklerin NAD+ ile oksidasyonu örnektir Alkol dehidrogenaz bu tip reaksiyonları katalizler
Ping-pong reaksiyonlarında bağlanma çok daha farklı gerçekleşir İlk substrat bağlandıktan sonra ilk ürün oluşur Benzer şekilde ikinci substrat bağlandıktan sonra ikinci ürün oluşur Yukarıdaki E* enzimin bazı değişikliklere uğradığını gösterir Bir polipeptidin bazı proteazlar ile ikiye ayrılması bu tip bir reaksiyondur
•Enzim inhibisyonu
Enzim aktivitesi bazı kimyasalların etkisiyle azalır veya tamamen biter Enzim aktivitesini bu şekilde değiştiren kimyasallara inhibitör (I) adı verilir İnhibitörlerle gerçekleşen İki tip inhibisyon vardırr
Dönüşümsüz inhibisyonu
Dönüşümlü inhibisyonu
Dönüşümsüz inhibisyon
Bu inhibisyon genelde inhibitörün enzime kovalent bağlanması ile gerçekleşir İnhibitörler bazen enzimin aktivite için gereken bir kısmını kalıcı olarak değiştirir İnhibitörler ayrıca enzimle kararlı bir kovalent harici etkileşime girebilir
Dönüşümsüz inhibitörler enzim reaksiyon mekanizmaları hakkında bilgi verirler
Birçok zehirlenme olayının temelinde dönüşümsüz inhibisyon yatar
İnhibisyonların grafik üzerinde incelenmesi
İnhibisyon tipi farklı [S] ve sabit [I] ile ölçülen reaksiyon hızlarından anlaşılabilir
Bunun için genelde ölçülen hızlara ait Linewear-Burk grafikleri kullanılır Yarışmalı inhibisyonda doğrunun eğimi değişirken 1/ v’yi kestiği yer aynı kalır [I] artırıldıkça doğrunun eğimi de artar Yarışmalı inhibisyonda yüksek [S] inhibisyonu kaldırır
[S] artırılınca inhibitörle yarışan S aktif bölgeyi tamamen doldurur Bu durumda enzim tam kapasite çalışır ve Vmax değişmez Doğru eğiminin inhibisyondaki artışı inhibitörün bağlanma kapasitesini gösterir Yarışmalı inhibisyon için Linewear-Burk eşitliği aşağıdaki gibidir Yarışmalı inhibisyonda doğrunun eğimi (1 + [I] / KI) çarpanı kadar artar Bu tip inhibisyonda inhibitör substrat bağlanmasını etkilediğinden Km değişir Km değerinin değişimi kadardır Mesala, Km= 10-4 olan enzim, I yokken v= Vmax / 2 değerine [S]= 10-4’ de ulaşır İnhibitör varlığında [I] = 2×10-3 M ve KI= 10-3 iken Km= 3×10-3 olur yani Km artar Klasik yarışmasız inhibisyon için Linewear-Burk eşitliği aşağıdaki gibidir Linewear-Burk grafiğinde doğrunun y-eksenini kestiği nokta yükselir Bir başka deyişle Vmax azalır ve azalma kadardır Km / Vmax ile verilen eğim ise aynı oranda artar Substrat bağlanması etkilenmediğinden Km değişmez KI ile ifade edilen inhibisyon sabiti KI : y0 [I] / yI – y0 eşitliğinden bulunabilir y0 inhibitörsüz reaksiyonda doğrunun y eksenini kestiği noktadır yI ise inhibitörlü reaksiyonda doğrunun y eksenini kestiği noktadır
Enzim aktivitesi çeşitli faktörlerden etkilenir
[S] [E] pH
Sıcaklık
İyonik şiddet
Kofaktör konsantrasyonu (kofaktör varsa)
İnhibitör ve aktivatör konsantrasyonları
•Enzim reaksiyon mekanizmaları
Bilinen çok sayıda enzim reaksiyonu vardır Yinede enzim reaksiyon mekanizmaları temelde birkaç tiptir Genel Asit-baz katalizi Geçiş-haline bağlanma ile kataliz Kovalent kataliz Metal iyon katalizi Reaktantların yakınlığı ve doğru yönlendirilmesi Elektrostatik kataliz Yapısal esneklik
Reaksiyonlar bu mekanizmaların bir kısmının kombinasyonu ile oluşur
Birçok enzim reaksiyonu genel asit-baz katalizi ile gerçekleşir
Bu tip kataliz için enzimler aktif bölge amino asit yan zincirlerini kullanır
Amino asit yan zincirleri genel asitler ve bazlar gibi davranır
Yan zincirler aktif bölgede proton transferleri için en uygun şekilde bulunur
His, Cys, Asp,Glu, Lys, Arg, Ser, Tyr yan zincirleri proton verir veya alır
Mesala protanlanmamış histidin genel bir baz gibi davranır
Protanlanmış histidin ise genel bir asit gibi davranır
Genel asit-baz katalizi en yaygın kataliz tipidir ve 3 şekilde gözlenebilir
Genel asit katalizi (General acid catalysis)
Genel baz katalizi (General base catalysis)
Eş zamanlı asit-baz katalizi (concerted acid-base catalysis)
Genel asit-baz katalizinde çeşitli asitler ve bazların protonları kullanılır
Spesifik asit-baz katalizinde sadece sudaki H+ ve OH- iyonları kullanılır
Enzimler bazen reaksiyonun geçiş haline de bağlanabilirler
Bunun sebebi bazı enzimlerin geçiş hallerine daha ilgili olmalarıdır
Enzimin geçiş haline bağlanması geçiş halinin konsantrasyonunu artırır
Bahsedilen artış ise reaksiyon hızını doğru orantılı olarak artırır
Geçiş haline bağlanan enzimler için bazı inhibitörlerler söz konusu olabilir
Bu inhibitörlere geçiş hali analogları adı verilir
Bazı doğal antibiyotikler geçiş hali analoglarıdır
Geçiş hali analogları ilaç tasarımı için oldukça önemlidir
Kovalent kataliz ayrıca nükleofilik kataliz olarak da bilinir
Geçici bir E-S kovalent bağının oluşumu reaksiyonu hızlandırabilir
Bu bağ bir nükleofilik grup ile elektofilik bir grup arasında gerçekleşir
Genelde nükleofilik grup E’de elektofilik grup ise S’de bulunur
E ve S arasındaki bağ yıkılınca ürün ve serbest enzim açığa çıkar
Kovalent kataliz, kimotripsin ve tripsin gibi enzimlerce gerçekleştirilir
Enzimlerin üçte biri kataliz için metal iyonlarına ihtiyaç duyarlar
Metaloenzimler metal iyonuna sıkıca bağlıdır
Fe+2, Fe+3, Cu+2, Zn+2, Mn+2, Co+2 …
Bu kofaktörlerin daha çok katalitik rolleri vardır
Metaller ile aktive edilen enzimler metal iyonlara geçici olarak bağlanır
Na+, K+, Mg+2, Ca+2…
Bu iyonlar daha çok yapısal rollere sahiptir
Metal iyonları katalize 3 temel şekilde dahil olur
Substrata bağlanarak onları reaksiyona uygun bir şekilde yönlendirler
Redoks reaksiyonlarını gerçekleştirirler
Negatif yükleri elektrostatik olarak sabitler veya gölgelerler
Enzimler reaktantları için uygun yakınlık ve yönlendirme sağlar
Böylece aktivasyon enerjisi düşürülür ve geçiş hali oluşabilir
Enzimler substratlarına bağlanarak reaksiyonları 3 şekilde kolaylaştırır Enzimler, substratları, varsa kofaktörleri ve katalitik gruplarının yakın olmasını sağlar Birbirlerine uygun yakınlıkta olma tek başına kataliz hızını 5 kat kadar artırır Enzimler, substratlarını reaksiyon için uygun yönelmeler ile bağlar Substratların etkileşecekleri kısımları birbirlerine bakacak şekilde olmalıdır Birbirlerine göre doğru yönelme tek başına kataliz hızını 100 kat kadar artırır Enzimler, substratlarının ve katalitik gruplarının bağıl hareketlerini sonlandırır Enzimler sayesinde geçiş halindeki etkileşen grupların bağıl hareketleri çok azalır
Bu etki tek başına kataliz hızını 107 kat kadar artırır Bazı enzimlerde aktivite elektrostatik kataliz ile gerçekleşir Substrat aktif bölgeye bağlanırken su genellikle aktif bölgeden uzaklaşır
Yani aktif bölge organik bir solventin polarite karakterlerine sahiptir Ortamın dielektrik sabiti suyun dielektrik sabitinden çok daha düşüktür Dielektrik sabitindeki düşme zıt yükler arasındaki etkileşimleri artırır Yani elektrostatik etkileşimler sulu çözeltilerdekinden çok daha güçlüdür Böyle bir ortamda aktif bölge amino asit yan zincirlerinin pK’ları oldukça değişir

Bunun sebebi komşuluğundaki diğer yüklü gruplardır
Aktif bölgenin uygun yerlerindeki bazı yüklü gruplar kataliz açısından önemlidir Bahsedilen yüklü gruplar ile reaksiyon geçiş halinin kararlılığı sağlanabilir Bu şekildeki bir etki ise reaksiyon hızını artırır Bazı enzimlerde kataliz için yapısal esneklikten faydalanılır Substrat önce enzime zayıf bir şekilde bağlanır
Bağlanma enzimin konformasyonunu değiştirir Konformasyon değişikliği geçiş haline ilgiyi artırır ve geçiş halini kararlı kılar
Bu gelişmeler aktivasyon enerjisini (ΔG‡) düşürür ve reaksiyon gerçekleşir
•Enzimatik reaksiyonların düzenlenmesi
Metabolik yollarda birden çok enzim beraber çalışırlar
Glikoliz, TCA devri…
Metabolik yollarda bir enzimin ürünü bir diğer enzimin substratıdır
Bu tip enzimlere multienzim kompleksleri adı verilir
Bu komplekslerdeki enzimler çeşitli şekillerde bulunabilirler
Enzimler birbirleri ile fiziki teması söz konusu olabilir (enzim kompleksi)
Yağ asidi sentetaz enzim kompleksi
Enzimler arasında fiziki bir temas olmayabilir
Glikoliz enzimleri
Enzimler membran gibi bir vasıta ile fiziki temas halinde olabilirler
Elektron taşıma sistemi (ETS)
Multienzim sisteminin kinetiği tekbir enzimin kinetiğinden farklıdır
Sistemdeki her enzimin substrat ve kofaktörler için ayrı ayrı Km değerleri vardır
Reaksiyonların hızını en yavaş basamağı gerçekleştiren enzim belirler
Hücrede metabolik yol ürünlerine hep aynı seviyede ihtiyaç olmaz
Bu nedenle bu yolların hızları hücre ihtiyaçlarına göre ayarlanmalıdır
Bahsedilen ayarlamalar bazı enzimler tarafından gerçekleştirilir
Eğer enzimatik reaksiyonlar düzenlenirse metabolik yollar düzenlenir
Çoğu multienzim sistemi kendilerini düzenleyebilirler
Bu sistemlerin çoğunda artan son ürün metabolik yolun ilk enzimi inhibe eder
Metabolik yollardaki diğer ara bileşikler ise aynı şekilde davranamaz
Metabolik yolların hızını belirleyen enzimlere düzenleyici enzimler adı verilir
Multienzim sistemlerindeki çoğu düzenleyici enzimler ilk reaksiyonu katalizler
İlk basamağın hücrenin ihtiyaçlarına göre düzenlenmesi önemlidir
Düzenleyici enzimin birkaç basamak sonra olması sakıncalı olabilir
Başka metabolik yollar için gerekli olan enerji ve yapıtaşı israf edilebilir
Bir metabolik yol için birden fazla ürün de söz konusu olabilir
Bu durumda düzenlenme dallanma noktalarındaki enzimlerle sağlanabilir
Düzenleyici enzimler aşağıdaki bazı ortak özelliklere sahiptir
Düzenleyici enzimlerin çoğu allosterik enzimlerdir
Bu enzimlerin aktivitesi kendilerine bağlanan bazı moleküllerin etkisi ile değişir
Enzime bağlanan moleküller hücre içi enerji veya yapı taşı gibi ihtiyacları gösterir
Bu şekilde metabolik yollar hücrelerin ihtiyacına göre düzenlenir
Düzenleyici enzimler reaksiyonlarını dönüşümsüz olarak katalizlerler
Enzimin reaksiyonu gerçekleşmesi halinde metabolik yol tamamlanır
Düzenleyici enzimler farklı dokularda farklı aktiviteli formlara yani izozimlere sahiptirler
Metabolik yollar her doku için aynı derecede önemli değildir
İzozimler ile farklı dokulardaki metabolik yollar, dokuların ihtiyaçlarına göre düzenlenir
Düzenleyici enzimlerin hücre içi ömrü çok daha kısadır
Bu enzimlerin sentezi transkripsiyon (mRNA sentezi) seviyesinde düzenlenir
Hormonlar ve hücre içi bazı kimyasallar bu enzimleri sentez ve yıkımını etkileyebilir
Bu kimyasallar düzenleyici enzimlerin sentezini teşvik edebilir veya baskılayabilir
Düzenleyici enzimlerin kısa ömürlü olması değişen şartlara uyumu kolaylaştırır
•Enzim kinetiği soruları
Soru 1
Bir enzim A B + H2O reaksiyonunu katalizlemektedir
A için Km: 1 µM , Vmax : 8 µmol ürün / dk / mg enzim
Çözeltideki [A] : 50 µM iken 1 mg enzim ile 2 dakikada kaç µmol B oluşur?
Cevap
v: Vmax [S] / Km+ [S]’den v: (8 µmol ürün / dk)x(5×10-5 M) /10-6 M + 5×10-5 M olur
v: (8×10-6 mol / dk)x(5×10-5 mol / L) / 10-6 mol / L + 5×10-5 mol / L
v: 400×10-12 / 51×10-6 mol /dk : 7.84×10-6 mol / dk
v : 7.84 µmol / dk / mg enzim
mg enzim başına 2 dakika ise 2 x 7.84 : 15.68 µmol ürün oluşur
Soru 2
Bir enzim A B + H2O reaksiyonunu katalizlemektedir
1 mL’deki 0.1 mg enzim için [A] aşağıdaki gibi değişmektedir
t:0 dk iken [A] : 0.1 µmol / 1.0 mL, t:1 dk iken [A] : 0.09 µmol / 1.0 mL
Vmax: 0.5 µmol ürün / dk / mg enzim ise A substratı için Km nedir?
Enzim Michaelis-Menten kinetiğine uymaktadır
Cevap
v: µmol ürün / dk / mg enzim olduğundan µmol ürün / dk hesaplanmalıdır
Reaksiyon stokiyometrisine göre tüketilen A kadar B oluşur
Tüketilen µmol A: 0.1 – 0.09 : 0.01 µmol / dk oldugundan
v: 0.01 µmol / dk / 0.1 mg enzim veya kısaca v: 0.1 µmol / dk / mg enzim olur
Reaksiyon başında [A] : [S] : 0.1 µmol / 1.0 mL : 100 µmol / L : 100 µM’dir
v: Vmax [S] / Km + [S]’den 0.1: 0.5 x 100 / Km + 100 ve 0.1 Km+10: 0.5 x 100 olur
0.1 Km+10: 0.5 x 100 ise 0.1 Km : 50 -10 olduğundan Km:40/ 0.1 : 400 µM olur
Soru 3
Laktaz enzimi laktoza galaktoz ve glukoza yıkmaktadır
Laktoz için Km 0.9 mM iken Vmax ise 3.5 µmol/dk/mg laktaz olsun
Ortamda 5.7 µmol laktoz ve reaksiyon karışım hacmi ise 80 mL olsun
1 mg laktaz tarafından 1 dakikada kaç µmol glukoz oluşturulur ?
Cevap
1 mg laktaz ile 1 dakikada oluşan glukoz miktarı ile aslında v sorulmaktadır
Önce [S] hesaplanır
[S] : 5.7 µmol laktoz / 0.080 L: 71.25 µmol/ L veya 71.25 µM olur
Daha sonra ise Km’de µM cinsinden alındığında 900 µM olur
v: Vmax [S] / Km+ [S]’den v: 3.5 µmol/dk /mg(71.25 µM) /900 µM + 71.25 µM olur
v:0.26 µmol / dk / mg laktaz
mg enzim başına dakika da 0.26 µmol glukoz oluşur
Soru 9
Aşağıdaki tabloya göre Km ve Vmax değerlerini hesaplayınız
Grafikten farklı [S] için birim zamanda ilk hızlar (v) elde edilir
Grafikten de görüleceği 60. saniyeden sonra hiperbolik eğriler gözlenmektedir
Bu yüzden 60. saniyeden sonraki ilk hızlar dikkate alınamaz
Grafikten sadece 60. saniyeye denk gelen ilk hızlar dikkate alınır
Daha sonra 1/ v ve 1/ [S] değerleri hesaplanır
1/ v ve 1/ [S] değerleri kullanılarak Lineweaver-Burk grafiği hazırlanır
Soru 10
Aşağıdaki tabloya göre Km ve Vmax değerlerini hesaplayınız
Grafikte farklı [S] için birim zamanda (dk) oluşan nmol P yani ilk hızlar gözlenir
Grafikten de görüleceği 3. dakikaya kadar hiperbolik eğriler gözlenmemektedir
Bu nedenle 1 dk için ortalama ilk hızlar dikkate alınır
Daha sonra Lineweaver-Burk grafiği için 1/ v ve 1/ [S] değerleri hesaplanır
•KAYNAKLAR
1- Keha, E. E. ve Küfrevioğlu, Ö.İ., Biyokimya, Dördüncü baskı, Aktif Yayınevi, Erzurum, 2005.
2- Nelson, D.L. and Cox, M.M., Lehninger Principles of Biochemistry, Fourth edition, Worth Publishers Inc., USA, 2004.
3- Garret, R.H. and Grisham, C.M., Biochemistry, Second edition, Saunders College Publishing, USA, 1999.
4- Mathews, C.K. and van Holde, K.E., Biochemisrty, Second edition, Benjamin/Cummings, USA, 1996.
5- Koolman, J. and Roehm, K-H., Color Atlas of Biochemistry, Second Edition, Germany, 2005.
6- Magill, J.M., Problem Solving in Biochemistry; A Practical Approach, Macmillan Pub Co, USA, 1988.
7- Voet, D., Voet, J.G., Pratt, C.W., Fundamentals of Biochemistry, First Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, USA, 1999.
8- Kuchel, P.W., and Rallston, G.B., Biochemistry, McGraw-Hill, USA, 1998.
9- Hames, B.D. and Hooper, N.M., Instant Notes in Biochemistry, Second edition, Bios Scientific Publishers, UK, 2000.
10- Onat, T., Emerk, K., Sözmen, E.Y., İnsan Biyokimyası, Birinci Baskı, Palme Yayıncılık Ankara, 2002.
11- Pamuk, F., Biyokimya, Gazi Kitabevi, Ankara, 2000.