Etiket Arşivleri: ENSTRÜMANTAL ANALİZ

Enstrümantal Analiz Spektrofotometrik Yöntemler

ENSTRÜMANTAL ANALİZ

Spektrofotometrik yöntemler

ABSORPSİYON SPEKTROFOTOMETRİSİ

• Işının absorpsiyon düzeyinin ölçülmesi ile gerçekleştirilen analizlere absorpsiyometri denir.

• Doğal olarak renkli veya sonradan renklendirilen bir bileşiğin görünür bölgeye ait bir ışığı absorplamasına dayanan absorpsiyometrik yöntemlere kolorimetri denir.

• Spektrofotometri ise görünür bölge (visible, GB), Ultraviyole (UV), infrared (IR) bölgelerdeki belli dalga boyundaki herhangi bir ışının madde tarafından absorplanmasına dayanan yöntemlerdir.

• UV ve GB ışınları, daha çok kantitatif analizlerde, IR ışınları ise kalitatif analizlerde kullanılmaktadır

FOTOMETRİ, çok genel bir terimdir.

• Absorpsiyon dışında emisyon ölçümlerini de içine alır.

• Fotometri bir maddenin absorbe ettiği veya yaydığı ışının miktarının ölçülmesidir.

Fotometri tekniği 4 genel grupta toplanır.

1) Kolorimetrik veya spektrofotometrik analizler

2) Florometrik analiz metotları (Floresans özelliğe sahip maddelerin yaydığı ışının şiddetinin ölçülmesidir

3) Nefelometrik analiz metotları: Bir süspansiyon tarafından saçılan ışın miktarının ölçülmesi prensibine dayanır.

4) Türbidimetrik analiz metotları: bulanık bir çözelti içinden geçen ışın miktarının ölçülmesine dayanır.

Absorpsiyometride kullanılan temel kavramlar

• Kolorometrik ve spektrofotometrik analizler, kimyasal maddelerin ışığın bir kısmını absorbe edip bir kısmını da geçirmesi prensibinden yararlanılarak geliştirilen analiz yöntemleridir.

Lambert-Beer Yasası

absorpsiyon ölçümlerinin dayandığı kanundur.

Absorplanan fotonların sayısı, ortamdaki absorpsiyon yapan türlerin sayısı ile orantılıdır. Monokromatik ve I0 şiddetinde ışıma, ortamı daha küçük olan I şiddetinde terk eder.


Kaynak: http://content.lms.sabis.sakarya.edu.tr/Uploads/49147/39037/enstr%C3%BCmantal-uv-v%C4%B1s.pdf

Enstrümantal Analiz-1

Kaynaklar 1. Enstrümental Gıda Analizleri, Yaşar Hışıl, 2011, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir ENSTRÜMANTAL ANALİZ-1 2. Enstrümental Gıda Analizleri, Hasan Yetim, Mustafa Çam, 2009 Erciyes Üniversitesi Yayınları. Kayseri. Değerlendirme • Ara sınav : 60 % Dersin amacı: Gıda işletmelerinde standart özelliklere sahip bir ürün üretmek, bir başka • Kısa sınav: %10 (2 adet) deyişle kalitede sürekliliği sağlamak için gerekli • Ödev: 10% rutin analizleri yapmak amacıyla kullanılan • Uygulama:%20 enstrümental analiz yöntemlerinin prensiplerini ve uygulamalarını öğrenmek Dönem sonu değerlendirme • Dönem içi ortalama: 50% • Final sınavı: 50% Analiz yöntemleri Enstrümantal analiz nedir? Kalitatif (nitel) analiz: Bir maddenin hangi bileşenlerden oluştuğunun bulunması Kantitatif (nicel) analiz: Bileşenlerden her birinin hangi miktarda olduğunun • Herhangi bir maddenin yapı ve bileşimini aydınlatmak bulunması amacıyla maddenin fizikokimyasal (H+ iyon konsantrasyonu, elektrik iletkenliği, termal özellikler, ışık absorbsiyonu- Analiz yöntemleri ayrıca klasik ve enstrümental olarak da sınıflandırılmaktadır emisyonus, ışığı kırma, çevirme derecesi gibi) özelliklerinden faydalanılarak yapılan analizlere enstrümantal analizler denir. Klasik yöntemler Enstrümantal (aletli) analizler Volumetrik Maddenin ışın absorbsiyonu, • Kısaca, alet, ekipman veya analitik cihazlarla yapılan Gravimetrik analizler ışın emisyonu, Elektriksel, magnetik ve analizlerdir. radyoaktiflik gibi özellikleri üzerine kurulmuş yöntemler Terazi, etüv, fırın gibi temel • Enstrümantal analizlerin yapılışındaki temel prensip maddenin laboratuvar cihazlarının kullanılmasıyla major ve/veya kendi özelliğine uygun olarak gönderdiği sinyallerin uygun minör düzeydeki bileşenlerin tayin araçlarla belirlenerek algılanabilir forma dönüştürülmesi ve edilmesine denir. Bir örnekteki herhangi bir bileşenin cinsi veya derişimiyle orantılı sinyal üreten cihazlarla yapılan bunların değerlendirilerek miktarının ölçülmesidir. analize Enstrümantal Analiz denir.

Enstrümantal analizler temel olarak 3 bölümde Enstrümental analizler incelenir: 1. Kromatografik yöntemler: örneğin bileşenlerine ayrılmasını sağlayan yöntemlerdir Kromatografik yöntemler Spektral yöntemler Elektroanalitik yöntemler 2. Spektral Yöntemler: örneğin absorbladığı yada •Atomik absorbsiyon •Kromatografi •Ultraviyole visible spektroskopisi •Amperometri yaydığı ışımanın ölçülmesine dayanan •Kütle spektrometrisi •Infrared spektroskopisi •Kondüktometri •Elektroforez •Nükleer manyetik rezonans •X-ray spektroskopisi •Potansiyometri yöntemlerdir •Refraktometri •Voltimetri •Termal analiz •Radyokimyasal yöntemler •Elektogravimetri 3. Elektroanalitik yöntemler: örneğe elektriksel •Elektron spektroskopisi •Atomik floresans ve iyonizasyon sinyaller uygulandığında verdiği cevabı ölçen •Elektron spin rezonans yöntemlerdir KROMATOGRAFİK YÖNTEMLER Kromatografi yöntemi, ayrılacak bileşenlerin iki faz arasında Kromatografi : Bir karışımdaki bileşenlerin birbirinden ayrılmasını ve dağılması esasına dayanır Bunlar: tanımlanmasını gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır. 1) Sabit faz 2) Hareketli (mobil) faz • Yunanca Chroma: renk graphein : yazmak 1) Sabit faz (Durgun faz): Bir kolon içinde veya düz bir yüzeye Günümüzde kromatografi ayırma bilimini kapsamaktadır. tutturulmuş faz. Geniş bir yüzey alana yayılmış sabit bir yatak oluşturur. • Kromatografi renkli bitki pigmentlerinin ayrımı için Rus botanikçi M.S. Tsvett Sabit faz sıvı veya katı olabilmektedir, (1872-1919) tarafından 1903’te geliştirilen bir yöntemdir. Kullandığı kolonda renkli bantlar oluştuğundan, bu ayırma yöntemine kromatografi adını vermişti. 2) Hareketli faz (Mobil faz): Sabit fazın üzerinden veya arasından Günümüzde kromatografi, kimya ve biyokimyanın bütün alanlarında, biyoloji geçen faz. Örneklerin ayrılmasını sağlayan fazdır. kalite kontrol, araştırma, analiz, preparatif amaçlı ayırmalar ve fizikokimyasal Hareketli faz sıvı veya gaz olabilir. ölçümlerde kullanılmaktadır. Örnek karışımı hareketli faz tarafından sistemden taşınır. Bu sırada örnekteki Hareketli faz Bu durumda kromatografi şöyle tanımlanabilir bileşenler sabit ve hareketli faz arasında birçok etkileşime uğrar . Sistemde en az alıkonulan “hareketsiz bir destek maddesi üzerinde, karışımdaki bileşen önce taşınır. Daha kuvvetle tutulan bileşenlerin, başlangıçta bulunduklarından farklı bileşen ise daha geç çıkar. bölge veya fazlarda ayrılmasını sağlayan bir ayırma yöntemidir” Bir karışımdaki bileşenlerin fiziksel ve kimyasal özellikleri birbirinden ne kadar farklı ise Sabit faz Kromatografinin temel prensibi: karışımdaki bileşenleri ayırmak o kadar kolaydır. Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla, sabit faz üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya sürüklenmeleri esasına dayanır.

• Elüsyon : Kromatografide sabit fazın hareketli faz (çözücü) ile yıkanması işlemine elüsyon • Genel bir kural olarak bir seri maddeyi denir. ekstrakte etmede çözücünün yeteneği, maddeleri çözme yeteneği ile doğru orantılıdır. • Eluent: elüsyon işleminde kullanılan sıvıya denir. • Elüat: kromatografide kolonun dip kısmından alınan ve analiz edilmiş maddeyi içeren sıvı Polarite • Bir organik moleküldeki elektronlar her zaman eşit olarak paylaşılmaz. Bir elektron bulutu üzerinde bir atom diğerinden daha fazla güç oluşturabilir. • Moleküldeki atomlar arasındaki yük farkından doğan • Elektronegatifliği fazla olan atom bağ yapımında kullanılan elektronları kutuplaşmaya polarite denir. kendine daha çok çeker. Bunun sonucunda molekülde kutuplaşma meydana gelir. Molekülün bir ucu (+) diğer ucu (-) gibi davranır. Örn su moleküllerindeki O ve H arasında elektronlar eşit olarak paylaşılmamıştır. • Suda Oksijen negatif yüklü Hidrojen ise pozitif yüklüdür. • Eğer bir moleküldeki bağ elektronları her bağı oluşturan atomlar arasında eşit paylaşılmışsa molekülde yük farkı olmaz. Bu moleküller apolardır. örn Hegzan Kr. de polarlık kavramının önemi: 1) Maddelerin polarlığı çözeltideki davranışlarını büyük ölçüde etkiler • Polar maddeler polar çözücülerde çözünür ve 2) Maddelerin polarlıkları büyüdükçe adsorbtif etkileri de büyür 3) Maddeler benzer polarlıkta sıvılarda çözünmek isterler. Polar maddeler su çözücünün polaritesi arttıkça daha yüksek gibi polar sıvılarda polarlık gözlenir Orta polar maddeler dietil eter, kloroform gibi orta polar sıvılarda Apolar maddeler de hegzan gibi apolar sıvılarda çözünmek isterler • Su en polar çözücüdür. Polar organik çözücüler 4) Benzer polarlıktaki maddeler birbirleriyle karışabilirler. Polarlıkları birbirine suda çözünebilir. Apolar çözücüler ise zıt olan iki sıvı birbirine karıştırılamaz 5) Moleküllerin polarlığı içerdikleri atomların özelliklerine ve molekül biçimine çözünmez dayanır (-F), (-OH),(NH2), (-Cl) gibi atom veya gruplar moleküle polar karakter kazandırır. 6) Maddeler polar çözücülerde çözündüklerinde polarlıkları artar

APOLAR • Hegzan • Heptan Kromatografik yöntemlerin sınıflandırılması • Siklohegzan • 1-4 dioksan • Benzen Elüotropik seri: Kr’de kullanılan 1.Ayrılma Mekanizmalarına Göre çözücülerin elüsyon güçlerine göre • Toluen • Asetonitril sınıflandırlması 2. Uygulama Biçimine Göre • Dietileter Ayrılacak bileşenler için hangi 3.Faz Tiplerine Göre • Kloroform çözücünün kullanılması gerektiğine karar vermekte kullanılır. • Formik asit • Etil asetat • Asetik asit • Diklorometan • Bütanol • Aseton • Etanol • Metanol • Su POLAR 1. Ayrılma Mekanizmalarına Göre 2. Uygulama Biçimine Göre • Kağıt kromatografisi • Adsorpsiyon kromatografisi • İnce tabaka kromatografisi (TLC) • Partisyon kromatografisi • Kolon kromatografisi • İyon değiştirme kromatografisi • Gaz kromatografisi (GC) • Jel filtrasyon kromatografisi • Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) • Afinite kromatografisi 1.Ayrılma mekanizmalarına göre 3. Hareketli Faz Tiplerine Göre Sıvı kromatografisi (hareketli faz sıvı) a) Adsobsiyon kromatografisi • Sıvı-Katı kromatografisi • Adsorpsiyon : bir karışımda bulunan maddelerin katı • Sıvı-Sıvı kromatografisi faz üzerine tutunmasıdır. • Adsorbsiyon olayı, maddenin ara yüzeyinde bulunan Gaz kromatografisi (hareketli faz gaz) moleküller arasındaki kuvvetlerin dengelenmemiş olmasından ve Van der Waals kuvvetlerinden ileri • Gaz-Katı kromatografisi gelir. • Gaz-Sıvı kromatografisi • Yüzeyde konsantrasyonu artmış olan cisme adsorplanmış madde, adsorplayıcı maddeye de adsorban ya da adsorblayıcı madde adı verilir

Bir adsorbsiyon kromatografisinde sabit fazın özellikleri Adsorpsiyon kromatografisi ise örnek bileşenlerinin aşağıdaki gibi olmalı dolgu maddesinin yüzeyinde farklı olarak tutunmaları sonucu meydana gelen bir ayırma işlemidir. • Ayrılması gereken maddeleri parçalamamalı • Adsorpsiyon kromatografisinde; maddeler katı olan sabit faz • Ayrılması beklenen maddeler ile kimyasal reaksiyon ile sıvı veya gaz olan hareketli faz arasında etkileşir. vermemeli Faz tiplerine göre adsorpsiyon kromatografisi • Adsorbsiyon kapasitesi yüksek olmalı • sıvı-katı • Adsorbladıkları maddeleri kolaylıkla geri vermeli • gaz-katı kromatografisidir. Kromatografide kullanılan adsorbantlar b) Partisyon (dağılma) kromatografisi • Kuvvetli adsorbanlar: aktif kömür, alüminyum oksit, magnezyum oksit, silika jel, silikatlar • Partisyon: Katı destek maddesinin üzerinde ince bir sıvı film • Orta adsorbanlar: CaO, Ca(OH) , CaSO , tabakası oluşur. Bu oluşan sıvı hareketli faz ile karışmaz. 2 4 Ayırımı yapılacak olan madde, bu sıvılardaki çözünürlüğüne BaCO , MgCO , CaCO 3 3 3 bağlı olarak iki faz arasında dağılır ve dengeye ulaşır. Buna • Zayıf adsorbanlar: Nişasta, selüloz partisyon denir. Sabit faz: sıvı Hareketli faz : sıvı veya gaz c) Jel filtrasyon (jel geçirgenlik) kromatografisi • Sabit faz, yüksek yüzey alanlı gözenekli bir katı destek Maddelerin molekül ağırlıkları (büyüklüklerine) farklılıklarına maddesine emdirilmiştir. göre ayrılmasına dayanan bir yöntemdir. • Kolon küresel yapıda ve belirli boyutta gözeneklere sahip inert Destek:partisyon kromatografisinde, sıvı sabit fazın adsorblandığı jel parçacıklarından oluşmuştur. materyaldir. • Yöntemin esası: farklı boyutta molekülleri içeren bir çözelti • Ayırım çözünürlük esasına göre karışımın sabit ve hareketli faz kolondan geçirildiğinde büyük moleküller gözenekli arasındaki dağılımına dayanır. Ayırımı gerçekleştirilecek taneciklerin aralarındaki boşluklardan geçerek kolonda hızla bileşikler hareketli ve sabit faz sıvılarında farklı çözünürler. ilerlerler. Gözenek boyutundan küçük moleküller ise gözenek Çözünürlük farkından dolayı bileşikler sistemi önce veya sonra içerisinde difüzlenir ve molekül küçüldükçe artan bir alıkonma terk ederler. Çözünürlüğü sabit fazda fazla olan bileşikler süresi ile kolondan çıkarlar. sistemde daha uzun süre tutulduğu için sistemi daha geç terk ederler.

Bu yöntem protein, nükleik asit, polisakkarit ve diğer biyolojik moleküllerin saflaştırılmasında önem taşımaktadır. Bu kr de başlıca 4 jel tipi vardır. – Doğal bir polisakkarit olan dekstran ilk geliştirilen jeldir. – Poliakrilamit jeller – Agaroz jeller – Poliakrilamit-agaroz karşımı jeller d) İyon değiştirme kromatografisi • Çevresindeki ortamda bulunan iyonlarla yer değiştirebilen iyonlara sahip özel materyal (iyon değiştirici) kullanılır. • Sabit fazın yükü (-) ise katyon değiştirici, (+) ise anyon değiştirci olarak adlandırılır • Bu materyaller anyon ve katyon değiştiriciler olabilir. • İyon değişimi kromatografisi genellikle proteinler aminoasitlerin saflaştırılmasında kullanılır. • Örnekteki yüklü gruplar ile katı destek maddesi arasında elektrostatik etkileşimler olur. Örnek ile destek maddesi ters yüklere sahip olmalıdır. İyonik • zeolit veya reçineler bu iyon değiştiricilere örnek bağlarla örnek destek maddesine bağlanır. Değişen konsantrasyonlarda (ya da olarak gösterilebilir. pH’larda) elüsyon çözeltisi ortama verilerek ayırma işlemi gerçekleştirilir. • (-) veya (+) yükü fazla olan bileşenler kolonu daha geç terkeder • Reçineler rejenerasyon ile tekrar kullanılabilir Reçine Zeolit e) Afinite (ilgi) kromatografisi • kromatografik yöntemlerin en yenisidir. • Biyolojik etkileşim temeline dayanır. • Özellikle protein (enzim) saflaştırmada kullanılır. • Kolon dolgu madde kovalent olarak bağlanmış ve saflaştırılacak proteine özel ilgi (afinite) göstererek seçinimli bir ayırım sağlayan, ligand adı verilen küçük moleküllerin kullanımıyla gerçekleştirilir.

2) Uygulama biçimine göre kromatografi çeşitleri KOLON KROMATOGRAFİSİ • Kolon dolgu maddesi ile doldurulmuş, alttan musluklu basit cam bir boruda gerçekleştirilebilir. • Bunun yanında metal ve dayanıklı plastik de kullanılabilir. • Genellikle 1-4 cm çapında, 20-100 cm uzunluğunda kolonlar kullanılır. • Kolonun alt kısmı, dolgu maddesini (katı adsorbantı) tutmak için gözenekli ya da ince delikli camdan yapılmıştır. • Ayırma mekanizmalarına göre 5 farklı kolon Kolonun doldurulması: kromatografisi uygulanabilir: • Kolonun altındaki musluk kapatılarak • Partisyon kolonun • Adsorbsiyon ¾’üne kadar çözücü doldurulur. Dolgu maddesi üst taraftan yavaşça dökülür. İyice • İyon değişim kromatografisi yerleşmesi beklenir. Sonra kolonun altındaki • Jel filtrasyon kr. musluk açılarak çözücünün fazlası akıtılır. • Affinite kromatografisi Kolon birkaç defa çözücü ile yıkanır. Böylece hem kolon temizlenmiş olur, hem de dolgu maddesi kolona yerleşmiş olur. Ayrıca, ortamda hiç hava kalmamış olur. Kolon dolgu maddeleri • Daha sonra, dolgu maddesinin üst yüzeyine uygun Kromatografide kullanılan dolgu maddelerinin genel özellikleri büyüklükte bir süzgeç kağıdı diski konularak sonraki şöyle olmalıdır: uygulamalarda destek madde yüzeyinin bozunmaması sağlanır. 1) Partikülleri aynı boyutta (uniform) olmalıdır 2) Tanecikler kullanılan çözücü içinde çözünmemelidir 3) Ayırımı yapılan bileşiklere karşı inert olmalıdır • Kolondaki dolgu maddesi hiçbir zaman 4) Çözücünün uygun hızda hareketine engel olmamalıdır kurumamalıdır. Bu durumda tüm özelliğini kaybeder.

Enstrümantal Analiz-2

• Düzlemsel kromatografi 1- Kağıt kromatografisi ENSTRÜMENTAL ANALİZ-2 2- İnce Tabaka kromatografisi 1 2 • Kromatografi : Bir karışımdaki bileşenlerin birbirinden ayrılmasını ve • Adsorpsiyon : bir karışımda bulunan sıvı veya tanımlanmasını gerçekleştiren yöntemlerin genel adıdır. Kromatografi yöntemi, ayrılacak bileşenlerin iki faz arasında dağılması esasına dayanır gaz halindeki maddelerin katı faz üzerine Bunlar: tutunmasıdır. • 1) hareketli faz • 2) Sabit faz • Partisyon: Bileşenlerin iki sıvı arasında 1) Sabit faz-durgun faz (Stationary phase): Bir kolon içinde veya düz bir yüzeye dağılması tutturulmuş faz. Geniş bir yüzey alana yayılmış sabit bir yatak oluşturur. • Sabit faz sıvı veya katı olabilmektedir, 2) Hareketli faz (Mobile phase): Durgun fazın üzerinden veya arasından geçen faz. Örneklerin ayrılmasını sağlayan fazdır. • Hareketli faz sıvı veya gaz olabilir. 3 4 Kağıt kromatografisi (KK) Paper chromatography (PC) • KK genellikle kalitatif amaçlı kullanılır. Bazen kantitatif amaçlı kullanılabilmektedir. • Uygulaması en basit olan kromatografi yöntemidir • KK uzun zaman gerektirmesi ve beneklerin daha fazla • genellikle süzgeç kağıtları (selüloz)kullanılarak yapılır yayılması nedeniyle ince tabaka kr kadar başarılı değildir • Bu yöntemde kalın bir süzgeç kağıdı destek; ve gözeneklerine yerlesen su ise, sabit “sıvı fazı” oluşturur. Hareketli faz bir yürütücü tank içine yerleştirilmis uygun bir sıvıdır. • KK sıvı-sıvı partisyon kromatografisidir.

Kağıt kr kullanılan kağıtlar Kullanılan kağıtlar Ticari marka Standart kağıtlar Whatman No.1 ve No. 2 Schleicherr and Schüll (S and S) 2043 n Macheray Nagel(MN) 260 Hızlı akış kağıtları Whatman 31 ET, 54 ve 4 S and S 2040 a Preparatif kartonlar Whatman 31 ET ve 3 MM S and S 2071 Karboksil kağıtlar S and S I ve ıı Asetillenmiş kağıtlar S. and S.2043 b/6, 2043 b/45 ve 2043 b/21, MN 214 Ac, 261 Ac ve 263 Ac İyon değiştirme kağıtları S. and S. Katyon ve anyon değiştirme kağıtları 7 8 KK’de kullanılan sabit fazlar 2) Hidrofilik organik sabit faz 1) Sabit sulu faz: • Bu, sudan başka bir hidrofilik fazın kullanılması durumudur. • Normal kağıt diğer bir sabit fazla doyurulur ve suyun etkisi ortadan kaldırılır. • Suyun sabit faz olduğu ve hareketli fazın bunun üzerinden ilerlediği en yaygın KK’dir. Kağıdın doyurulması: • Bunun için kağıt kapalı bir kapta suyla doyurulmuş bir atmosferde tutulur. • Uçucu organik çözücü ve kağıt kapalı ortamda dengeleninceye kadar tutulur veya uçucu olmayan çözücü içerisine kağıt yavaşça daldırılır ve hava akımı • Kuvvetli polar veya iyonik maddelerin ayırımı için sulu çözücü sistemler altında (saç kurutma makinası) çözücünün fazlası uzaklaştırılır. kullanılır • Bu amaç için genellikle %40 formamid / %60 etanol kullanılır. • Bu amaç için yaygın olarak kullanılan hareketli fazlar ise: Asit ortam sağlayan : n-bütanol + asetik asit + su (40+10+50) Bazik ortam sağlayan : n- bütanol + amonyak + su (75+8+12) Nötr ortam sağlayan ise : n-bütanol+alkol 9 10 3) Hidrofobik sabit faz (zıt faz kromatografisi) Bu amaçla kağıtlara çeşitli yöntemlerle hidrofobik özellikler kazandırılabilir. Seçilmiş hidrofobik çözücü ile kağıdın basitçe doyurulmasıyla kağıtlara hidrofobik özellik kazandırılmış olur. Modifiye hidrofobik kağıtlar da kullanılabilir • Polar sabit faz ve polar hareketli fazdan oluşan kromatografilere normal kromatografi denir. Zıt faz kr’de kullanılan tipik kombinasyonlar (polarite artışına göre) • Sabit fazın apolar (hidrofobik) olduğu kromatografi türüne de zıt faz a) Likit parafin sabit fazı: benzende %10 oranında hazırlanarak kağıda uygulanır, (hidrofobik) kromatografisi adı verilir. hareketli faz olarak da dimetil formamid+metanol+su (10+10+1,h/h/h) kullanılır • Zıt faz kr. Apolar bileşiklerin ayrılmasında kullanılır. Sistemde hareketli faz b) kerozen: petrol eterinde %10 oranında hazırlanarak kağıda uygulanır mobil faz olarak önce polar bir çözücü (örn su) kullanılır. Örnekteki polar olan olarak izopropanol+su (7+3) veya glasiyel asetik asit kullanılır. bileşenler ayrıldıktan sonra apolar bir çözücü kullanılarak istenen bileşikler ayrılır. c) dimetil formamid: etanolde % 50 oranında hazırlanarak kağıda emdirilir, mobil faz olarak da siklohegzan kullanılır. Bunlardan başka çeşitli kombinasyonlar da kullanılabilir.

KK’nin yapılışı • Örnek ve standartlar aynı kağıt üzerine 1) örneğin kağıda uygulanması birbirleri arasında en az 2.5 cm uzaklık olacak şekilde damlatılmalıdır. • Genellikle 20×20 cm boyutunda • Kağıt kenarları arasında da 2.5 cm boşluk selüloz kağıdı üzerine 2-25 μg örnek olmalıdır. ekstraktını içerecek şekilde, uygun çözücüde çözülerek damlatılır. 2) Kağıdın geliştirilmesi (developmanı) Damlatma işleminde mikropipet • Developman tankı silindirik, dikdörtgen kullanılır. 5μL örnek yeterlidir. prizma ve küp şeklinde olabilmektedir. • Tankın kapağı kapatılmış olmalıdır. • Örnek çapının büyük olmaması için • Developman (geliştirme): kr de çözücü örnek birkaç hamlede verilir. yardımıyla bileşiklerin ayrılması işlemine • Örnek çapının küçük olması istenir developman denir. 13 14 • Tank cam veya metalden yapılmış olabilir. • Tankın boyutları içerisine konacak kağıdın boyutlarına uygun • Kağıdın alt kenarı çözücüye 1-1.5 cm kadar olmalıdır. batmış olmalıdır. • Bu işlem sırasında kağıt çözücüye paralel • Yürütücü çözücü (developman çözücüsü) önceden tanka konmalı ve yürütücü çözücüye doğrudan temas etmeyecek pozisyonda tutularak daldırılmalı ve kesinlikle şekilde kağıt tankın içerisine asılarak tank atmosferi ve kağıt benekler çözücü ile doğrudan temas çözücü buharıyla doyurulmalıdır. etmemelidir. • Çözücü buharıyla doyurulmuş kağıda örnek ve standartlar damlatıldıktan sonra kağıt tekrar tankın içerisine yerleştirilir. 15 16 Kromatogramın değerlendirilmesi • Kağıt tanka yerleştirildikten sonra tankın kapağı hemen kapatılarak çözücünün kağıt üzerinden yükselmesi sağlanır. Çözücü kağıt üzerine 3 cm • Tanktan alınan ve kurutulan kağıt incelenir. Eğer kadar yaklaşınca tankın kapağı açılarak kağıt tanktan çıkarılır. Böylece ayrılan bileşikler gözle görülebiliyorsa kağıdın developmanı tamamlanmış olur. beneklerin Rf (retention factor) değerleri • Kağıdın üzerindeki çözücünün hızla buharlaştırılması gerekmektedir. Aksi ölçülür. halde difüzyon etkisiyle benek çapları büyüyecektir. Rf değeri: bileşiğin aldığı yolun çözücünün aldığı • Kağıt açık havada veya etüvde kurutulur. yola oranıdır.

• Rf değeri 0 ile 1 arasında bulunur • Rf değerleri, standartların Rf değerleri ile • hızlı yürüyen komponentler için alınan mesafe büyük karşılaştırılarak kalitatif analiz yapılmış olur. olacağından Rf değeri büyük, daha yavaş yürüyenler için daha küçüktür. Yarı kantitatif tayin: standartların benek çapı • Rf değeri: veya alanına karşı konsantrasyonla kalibrasyon sıcaklığa grafiği çizilir. Buradan örnek beneğinin çapı kağıdın cinsine veya alanına karşı konsantrasyon bulunur. kullanılan yürütücü karışımın cinsine bağlıdır. • Aynı sistem için Rf değeri sabittir. 19 20 • Eğer kağıt üzerinde ayrılmış bulunan benekler renksiz • Bazı renksiz benekler de kimyasal reaksiyonla görünür hale ve gözle görülemiyorsa bunların incelenmesi için getirilerek incelenir. görünür hale getirilmesi gerekir. Bunun için kağıt UV ışık altında incelenebilir. • Örneğin, kağıt üzerinde ayrılmış bulunan ve görülmeyen aminoasitler ninhidrin ile reaksiyona sokularak görünür hale getirilir. • UV ışıkta benekler belli bir ışıkta belirginleşmeye • Bunun için kağıt üzerine reaktif püskürtülür veya kağıt reaktif başlar. Beneklerin bulunduğu yer bir kurşun kalemle çözeltisine daldırılır. işaretlenir. 21 22 İki boyutlu (two dimentional) kromatografi KK’sinin gıda analizlerinde uygulamaları • Bir karışımda Rf değerleri birbirine çok yakın bileşikler • Günümüzde KK daha çok kalitatif amaçlarla belli bir bulunuyorsa bunların ayrılmasında kullanılır. komponentin karışımdan ayrılması için kullanılır. • Kağıdın kenarlarından 2.5 cm içeride bir köşesine damlatılan • Kağıt üzerinde ayrılmış olan benek kesilerek uygun bir örnek önce 1. çözücü ile yürütülür. Daha sonra aynı kağıt çözücüde ekstrakte edilip bileşen başka teknik kurutulur ve 90 derece döndürülerek, kısmen ayrılmış analizlerde de kullanılabilir. beneklerin daha iyi ayrılmasını sağlamak için ikinci (farklı) bir çözücüde geliştirilir. Böylece iki boyutta ayrılma ile örnek bileşenlerinin daha iyi ayrılması sağlanmış olur.

• Karbonhidratlar da KK ile ayrılabilir. Örn diyet • Baharatlarda bulunan fenoller KK ile ayrılabilir. gıdalardaki glikoz, fruktoz, sakkaroz, ve laktoz belirlenebilir. • Doğal ve yapay sirke KK ile belirlenebilir. Doğal sirkede aminoasitler vardır, ancak sentetik • Sucuk, sosis ve diğer et ürünlerine süt tozu katılıp sirkede yoktur. KK ile aminoasitler belirlenerek katılmadığı, laktoz hidroliz edilip galaktoz ve glikoza sirkenin doğal olup olmadığı belirlenebilir. dönüştürüldükten sonra KK ile belirlenebilir. • Bazı meyve sularındaki şekerlerde bu yöntemle belirlenebilir. 25 26 Ince Tabaka Kromatografisi (İTK) Thin layer Chromatography (TLC) • İTK’de ayırmada genel kural: örneği oluşturan bileşenlerin polarlık derecelerine uygun polarlıkta • İnce tabaka kromatografisi, bir “katı –sıvı adsorpsiyon çözücü seçmektir. kromatografisidir.” • Çoğu kez apolar bileşikler için kuvvetli aktif • sabit faz : bir plaka üzerine ince bir tabaka halinde sıvanmıs katı adsorbant maddedir. adsorbantlar; Polar bileşikler için ise zayıf aktif adsorbantlar seçilir. • Hareketli faz: sıvı • Bu yöntemde hareketli fazın sabit faz üzerinden ilerleyisi, • Yürüme hızı: ayrılacak bileşenin, katı fazın ve asağıdan yukarı doğru olur. Çözücü kılcallık etkisi ile içerisine çözücünün polaritesine bağlıdır. daldırılan ince tabaka plakası üzerinde yürür. 27 28 İTK’sinin KK’sine üstünlükleri • Adsorban madde olarak kolon kromatografisinde kullanılan tüm katılar (alumina,silika jel, sellüloz vb.) kullanılabilir. • 1) İTK’de silikajel, celite, alüminyum oksit, gibi inorganik ve • İTK’de dolgu maddeleri cam veya plastik plaka üzerine 1 selüloz, poliamid gibi organik adsorbantlarla ince tabakalar mm’den daha az kalınlıkta yayılarak kaplanır. oluşturularak ayırma gerçekleştirilebileceği halde, KK’de selüloza bağlı kalınır. • Plakalar genellikle 20×20 cm boyutundadır. • İTK’de ayrılacak maddeye göre uygun adsorbant seçme kolaylığı vardır.