Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dergisi Cilt 32 / Sayı 2 / Temmuz 2012 / ss. 209-242 Gelişmiş Ekstraksiyon Teknikleri I Geliş tarihi : 20.12.2011 Düzeltme tarihi : 27.02.2012 Kabul tarihi : 08.03.2012 Ebru Büyüktuncel*0 Giriş Nitel ve nicel analiz, bir örnek hazırlama işlemine karar verir. Ekstrak- siyon basamağı, çoğu analitik işlemlerin vazgeçilmez bir parçasıdır. 1879 yılında F. Soxhlet tarafından geliştirilen ve 1980’lerin ortalarına kadar çok popüler olan Soxhlet ekstraksiyonu günümüzde hala rutin laboratuvarların çoğunda kullanılmaktadır. Son yıllarda gelişmiş ekstrak- siyon tekniklerine artan bir talep olmuştur. Bunun nedeni, otomasyona uygun olması, ekstraksiyon zamanının kısalması, organik solvent tüketi- minin azalması, analitik laboratuvarlarında kirliliğin önlenmesi ve örnek hazırlama maliyetindeki azalmadır1,2. Yeni teknolojilerin gelişimine paralel olarak, ekstraksiyon prensiplerinin temel anlayışı ilerlemiştir. Bu ilerleme, örnek hazırlamada yeni yönelimlere yol açmıştır. Bunlar, mikroekstraksi- yon, minyatürleştirme ve analitik işlemlerde kullanılan örnekleme, ayırma ve kantitasyon basamaklarının entegrasyonudur3 . Bu yüzden örnek hazırlamada, klasik ekstraksiyon tekniklerinin yerini mikro- dalga-destekli ekstraksiyon, süperkritik sıvı ekstraksiyonu, basınçlı sıvı ekstraksiyonu (veya hızlandırılmış solvent ekstraksiyonu), soni- kasyon-destekli sıvı ekstraksiyonu gibi teknikler almıştır. Bu teknikler arasındaki benzerlik, ekstraksiyon olayının hızını önemli ölçüde artıran, yüksek sıcaklık ve basınçta çalışma olasılığıdır.

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ DERGİSİ Örnek Önişlemleri Bir örneğin analizi; örnekleme, örnek hazırlama, örnek analizi ve veri işleme olmak üzere dört farklı basamaktan oluşur. Örnek önişlemleri, modern analitik metodolojinin örnek hazırlama basamağında önemli bir rol oynar ve örnekleme ile birlikte anahtar basamaklardan birisidir. Aynı zamanda, analizin en fazla hataya eğilimi olan kısmıdır. Örnek önişleminin amacı, ilgilenilen analitleri matriksten izole etmek ve analizin seçiciliğini, tayin edilebilirliğini, güvenilirliğini, doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini artırmaktır. Örnek hazırlama, kirli olarak adlandırılan kompleks örnekler için çoğunlukla temizleme işlemlerini içerir. Buna ilaveten, genel- likle analitlerin analitik yöntem tarafından ölçülebilen uygun seviyeye zenginleştirilmesi gereklidir. Gerekli örnek hazırlama, örneğin doğasına ve kullanılan anali- tik metoda bağlıdır. Örnek matriksleri, organik veya inorganik olarak sınıflandırılabilir ve katı, sıvı veya gaz şeklinde alt gruplara ayrılabilir. Örneğin homojenizasyonu ve kurutması, genelde örnek işleminin ilk basamaklarıdır. Bir sonraki örnek önişlem basamağı genellikle ekstraksi- 4 yondur. Çok yaygın ön işlem yöntemleri Tablo I’de liste halinde verilmiştir . Soxhlet Ekstraksiyonu Soxhlet ekstraksiyonu özel bir cihazda gerçekleştirilir (Şekil 1). Katı veya yarı-katı numuneler için uygundur. Soxhlet ekstraktörü, en eski ekstraksiyon sistemlerinden biridir ve hala geniş ölçüde kullanılmaktadır. Soxhlet ekstraktörü, bir solvent şişesi, orta çemberde bir sıvı akış borusu (sifon), soğutulmuş bir kondansör (yoğuşturucu) ve ısıtma sisteminden meydana gelmiştir. Katı örnek, orta çemberin içindeki ektraksiyon bölmesinin içine yerleştirilir. Solvent bunun altındaki solvent şişesinin içine konur. Sol- vent kaynama sıcaklığının üzerinde ısıtılır ve kaynayan solventten gelen buharlar yoğunlaşmanın olduğu kondansatöre hareket eder; yoğunlaşır, örneğe doğru damlar. Solvent örneği ıslatır ve daha sonra solvent seviyesi sifonun tepesine ulaşır ulaşmaz, solvent tüm örnek bölmesini boşaltarak, solvent şişesine geri damlamaya başlar. Böylece sıcak solvent birkaç kere örnek içerisinde sirküle olur. Ekstrakte olan analitler solvent şişesinin

GELİŞMİŞ EKSTRAKSİYON TEKNİKLERİ I 211 TABLO II En yaygın kullanılan örnek önişlem teknikleri Yöntem Örnek tipi Tartma Sıvı, katı Kurutma Gaz, sıvı, katı Fitrasyon Sıvı pH ayarlama Sıvı Homojenizasyon Katı Öğütme (Grinding) Katı Çöktürme Biyolojik örnekler Karıştırma Gaz, sıvı, katı Özümseme (Digestion) Katı biyolojik örnekler Hücre parçalanması (cell disruption) Katı, sıvı biyolojik örnekler Diyaliz Sıvı Ultrafiltrasyon Sıvı Harmanlama, karıştırma (blending) Katı Lipofilizasyon (Freeze-drying) Katı örnekler, biyolojik örnekler Sonikasyon Sıvı, katı İz zenginleştirme (trace enrichment) Tümü Santrifüjleme Sıvı Seyreltme Sıvı Solvent değiştirme Sıvı Soxhlet ekstrasiyonu Katı Sıvı-sıvı ekstraksiyonu Sıvı Sıvı-katı ekstraksiyonu Sıvı, gaz Süperkritik akışkan ekstraksiyonu Katı Gaz boşluğu (Headspace) teknikleri Gaz, sıvı, katı Mikrodalga destekli ekstraksiyon Sıvı, katı Ses dalgaları destekli ekstraksiyon Sıvı, katı Matriks katı-faz dispersiyonu Sıvı, katı Basınçlı sıvı ekstraksiyonu Katı, yarı-katı Su buharı distilasyonu ekstraksiyonu Sıvı, katı Katı-faz mikro ekstraksiyon Sıvı, gaz Membran ekstraksiyonu Sıvı, gaz Karıştırma çubuğu sorptif ekstraksiyonu Sıvı, gaz (Stir bar sorptive extraction) Türevlendirme Sıvı, katı Deriştirme Tümü Kolon kromatografisi Sıvı (ekstraktlar) İç standart ekleme Tümü

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ DERGİSİ Şekil 1 Soxhlet ekstraktör cihazı içinde kalırken, yalnızca temiz solvent buharlaştığından, her dolaşımda taze solvent kullanılır. Çevrim sayısını ve ekstraksiyon zamanını rapor et- mek daha iyi bir karşılaştırma için önemlidir. Tipik ekstraksiyon zamanları 6 saatten 24 saate kadardır ve oldukça büyük solvent hacimleri (100-500 mL) gereklidir. Ekstraksiyon solventleri genellikle saf organik solventler veya bunların karışımlarıdır. Soxhlet ekstraksiyonu, esas olarak organik bileşiklerin katı örneklerden ekstraksiyonunda kullanılır. Bileşikler, sol- ventin kaynama sıcaklığında termal olarak kararlı olmalıdır. Eşzamanlı ekstraksiyona izin veren Soxhlet cihazı çok düşük maliyetle temin edi- lebilir. Yöntemin kullanılması esnasında karşılaşılan problemler örnek bölmesinin temizliğinden kaynaklı olabilir. Kullanmadan önce, temiz bir 4 solventle ekstrakte ederek temizlemek en iyisidir . Geleneksel Soxhlet ekstraksiyonu bazı cazip avantajlara sahip- tir. Örnek, sürekli olarak taze solvent ile temas halindedir. Böylece matriksten analitin uzaklaştırılması artar. Distilasyon balonuna uygu-

GELİŞMİŞ EKSTRAKSİYON TEKNİKLERİ I 213 lanan ısıyla, ekstraksiyon kavitesine ulaşıldığından, sistemin sıcaklığı oda sıcaklığından daha yüksek olur. Sistem bu yüksek sıcaklıkta değişmeden kalır. Ayrıca, özütlemeden sonra filtrasyona gerek kalmaz ve örnekten üretilen madde miktarı, birkaç eşzamanlı ekstraksiyon para- lel olarak gerçekleştirilerek arttırılabilir. Düşük maliyetli basit ekipman kullanılması buna olanak sağlar. Dahası, Soxhlet ekstraksiyonu az uğraş gerektiren çok basit bir metodolojidir. En son kullanılan alternatiflerinin çoğundan (mikrodalga destekli ekstraksiyon, süperkritik sıvı ekstraksi- 5,6 yonu gibi) daha fazla miktarda örnek kütlesi ekstrakte edilebilir . Soxhlet ekstraksiyonunun diğer katı örnek hazırlama teknikleriyle karşılaştırıldığında en önemli dezavantajları, uzun zaman gerektirmesi ve büyük miktarda organik solvent kullanmasıdır. Çok miktarda solventin zararsız hale getirilmesi yalnızca pahalı değil, aynı zamanda çevresel problemlerin kaynağıdır. Örnekler genellikle solventin kaynama noktasında uzun süre ekstrakte edilir. Bu da termal olarak kararsız olan hedef türlerin bozunmasına yol açabilir. Geleneksel Soxhlet cihazı, süre- cin hızlanmasına yardımcı olan çalkalama sağlamaz. Büyük miktarlarda solvent kullanıldığından, ekstraksiyon sonrası buharlaştırma/deriştirme basamağı zorunludur. Soxhlet tekniği solvent seçiciliği ile sınırlıdır ve 6,7 otomasyonu zordur . Aynı temel prensibe dayanan Soxhlet ekstraktörlerinin modern versiyonları geliştirilmiştir. Bunlar, basınçlı Soxhlet ekstraksiyonu, otomatikleştirilmiş Soxhlet ekstraksiyonu, ses dalgaları destekli Soxhlet ekstraksiyonu ve mikrodalga destekli Soxhlet ekstraksiyonudur. Soxhlet ekstraksiyonu yüzyıldan fazla zamandır avantajlarını kanıtlamıştır. Bu avantajlar çoğu eksikliklerin üstesinden gelmiştir. Bunları şöyle sıralayabiliriz: 1. Basınçlı Soxhlet ekstraksiyonunda, örnek kartuşuna uygulanan basıncın artmasıyla, solventin katı örneğe nüfuz etmesi kolaylaşmıştır. Bunun sonucu ekstraksiyon zamanı kısalmış ve solvent hacmi de azalmıştır. Bununla beraber yüksek basınçta çalışmak, deneysel kurulumu zorlaştırmaktadır. 2. Otomatikleştirilmiş Soxhlet ekstraksiyonunda kullanılan farklı özellikteki birkaç ticari ekstraktörün ortak paydası: ekstraksiyon süresini kısaltma, ekstraktant (ekstraksiyon yapan madde) hacmini azaltma ve birkaç örneğin eş zamanlı ekstraksiyonuna olanak sağlamaktır. Bu

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ DERGİSİ cihazların en önemli kusuru yüksek maliyet ve çok yönlü olmamasıdır. 3. Dış enerjilerle ekstraksiyonun desteklenmesi (ultrasonik enerji ve mikrodalga kullanımı) Soxhlet ekstraksiyonunun eksiklerinin giderilmesi 6 için en iyi alternatiftir . Uygulamaları Soxhlet ekstraksiyonu hem çevresel analizlerde, hem de gıda analizlerinde uygulanmıştır. Falandysz ve arkadaşları balıkta poliklorlu bifenilleri tayin etmişlerdir. Balıkların kas dokuları alınmış ve homojenize edilmiştir. Petri kaplarında dondurulmuş ve liyofilize edildikten sonra hek- zan ile Soxhlet cihazının gelişmiş bir versiyonunda (Soxtec HT6) ekstrak- te edilmiştir. Analiz gaz kromatografisi-elektron yakalama dedektöründe 8 (GC-ECD) gerçekleştirilmiştir . Diagne ve arkadaşları, Soxhlet ekstraksi- yonu yöntemiyle fasülyeden organofosforlu bir insektisit olan fenitroti- 9 yon kalıntılarını ekstrakte etmişlerdir . 10 g örnek 24 saat boyunca 200 mL diklormetan ile solventin kaynama sıcaklığında muamele edilmiştir. Daha sonra uçurularak zenginleştirilen örnek yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve GC-ECD ile tayin edilmiştir. Basınçlı Sıvı Ekstraksiyonu (Pressurized Liquid Extraction, PLE) Ekstraksiyon için oldukça yeni bir tekniktir. Hızlandırılmış solvent ekstraksiyonu olarak da adlandırılır. Örneği sızdırmaz bir yüksek basınç ortamında tutarak, geleneksel solventler için daha yüksek sıcaklıklar kullanılmasına izin veren bir ekipman kullanır. Yükseltilmiş basınç, solventin daha yüksek sıcaklıklarda sıvı halde bulunmasını sağlar. PLE’de verim ve seçiciliği etkileyen kritik faktörlerden biri ekstraksiyon sırasında uygulanan sıcaklıktır. Yüksek sıcaklıkların kullanımı, van der Waals kuvvetleri, hidrojen bağı ve dipol çekim gibi analit-örnek matrik- si etkileşimlerinin bozulmasına yardımcı olarak ekstraksiyon verimini artırır10. Termal enerji kullanımı benzer moleküller arasındaki kohezyon ve farklı moleküller arasındaki adhezyon kuvvetlerinin üstesinden gelinme- sine yardımcı olur. Bu durumda geribırakma (desorpsiyon) süreci için ge- rekli aktivasyon enerjisi azalır. Yükseltilmiş sıcaklık solventin, çözünenin ve matriksin yüzey gerilimini düşürür. Bu yüzden örneğin ıslanması artar. Solvent yüzey geriliminde azalma, solvent kavitesinin daha kolay

GELİŞMİŞ EKSTRAKSİYON TEKNİKLERİ I 215 oluşmasını sağlar. Böylece analitlerin solventte daha hızlı çözünmesine izin verilir11. Artan sıcaklık sıvı solventin viskozitesini azaltır ve matriks partiküllerinin içine girmesini kolaylaştırır. Sıcaklık, güçlü analit ve matriks etkileşimlerinin bozulmasına yardım eder ve denge zamanını kısaltan difüzyon hızlarını artırır. Bu durum özellikle difüzyon kontrollü örneklerde daha hızlı ekstraksiyonlara izin verir. PLE’nin temel özelliği, gerekli solvent miktarını önemli ölçüde azaltırken, ekstraksiyon süre- cinin hızını artıran yüksek difüzyon sıvıları kullanmasıdır12. Yükseltilmiş sıcaklık nedeniyle ekstraksiyon kinetiği de daha hızlıdır. PLE’nin amacı, yüksek sıcaklık ve basınç kullanarak sıvı ekstraksiyonunu geliştirmektir. Yüksek sıcaklık ve basınç, solventin örnek matriksinin içine nüfuz etme kabiliyetini artırır. Genellikle ekstraksiyon, solventin atmosferik kay- nama noktasının üstündeki bir sıcaklıkta gerçekleştirilir. Analitlerin yayılma gücü ve çözünürlüğü, artan sıcaklıkla artmaktadır. Bu ekstrak- siyonu daha hızlı ve daha etkin yapmaktadır10, 13. Ekstraksiyon sırasında uygulanan basıncın temel avantajı, sıcaklık kaynama noktasının üzerine çıksa bile solventin sıvı durumda kalmasıdır. Ekstraksiyon esnasında yüksek basınç, solventin analite ulaşmasını engelleyen, matrikste bu- lunan hava kabarcıkları ile ilgili problemleri kontrol eder. Bu koşullar analitin çözünürlüğünü ve matriksten desorpsiyon kinetiğini artırır14. Bu yüzden tüm süreç Soxhlet ekstraksiyonundan daha hızlıdır. Isıtma sonrasında ekstraksiyon hücresi, solventin normal kaynama sıcaklığının altına kadar soğutulur. Daha sonra hücreye yüksek basınç uygulanır. Bu basınç, solvent ve ekstrakte edilen materyali bir filtreden geçerek dışarıya çıkmaya zorlar. Ekstraksiyon kinetiğini artıran 200°C’ye kadar yükseltilmiş sıcaklıkların kullanılmasından dolayı, solventin kaynamasını önlemek için 20 MPa kadar basınç gereklidir. Gerekli sol- vent miktarı, geleneksel sıvı ekstraksiyon yöntemlerinda kullanılan mik- tardan daha azdır. PLE’nin sınırlaması, ısısal kararlı olmayan örnekler 15 için uygun olmamasıdır . Bununla birlikte olası en yüksek sıcaklık ve basınç, mutlaka en yüksek verimle sonuçlanmaz. Bozucu etki de yapabilir. Ayrıca ekstrak- siyon verimini etkileyen birkaç değişken daha vardır. Bunlar; ekstraksi- yon zamanı, solvent seçimi, solvent hacmi ve yüklenen örnek miktarıdır. Orijinal örneğin bileşimine (organik bileşim, su içeriği, partikül boyutu ve heterojenite) ek olarak, örnek ön hazırlama teknikleri de (kurutma, 16 öğütme gibi) sonucu etkileyebilir .

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ DERGİSİ PLE statik modda, dinamik modda veya bunların kombinasyonuy- la gerçekleştirilebilir. Dinamik modda, solvent örneğin içinden akar. Statik basınçlı sıvı ekstraksiyonu manuel olarak kapalı bir kapta gerçekleştirilebilir. Fakat ekstraksiyon daha çok otomatik bir enstrü- manla gerçekleştirilir. Tipik bir PLE sistemi, bir fırın, ekstraksiyon hücresi, pompa ve basınç altında tutan sistem, birkaç vana ve toplama 17 kaplarından oluşur (Şekil 2) . Statik ekstraksiyon modu şu basamakları içerir: 1. Ekstraksiyon hücresine örneğin yüklenmesi 2. Hücrenin organik solvent ile doldurulması 3. Hücrenin sıcaklık ve basıncının ayarlanması 4. Örneğin belirli bir zaman ekstrakte edilmesi 5. Basıncın serbest bırakılarak solventin toplama kabına transfer edilmesi. Tüm ekstraktın toplama kaplarına ulaşmasını sağlamak için hücrenin temiz solventle yıkanması 6. Uygun bir gaz kullanarak örnekten solvent atıklarının temizlenmesi PLE sisteminde toplanan hacim miktarı hücre büyüklüğüne bağlıdır. 10-100 mL arasında olabilir. Bu yüzden son ekstraktı deriştirmek için Şekil 2 PLE sistemi

GELİŞMİŞ EKSTRAKSİYON TEKNİKLERİ I 217 17 buharlaştırma basamağı gereklidir . Örnek ekstraksiyon hücresine yüklenmeden önce, genellikle önişlem uygulanır. Toprak ve benzeri matrikslere hava ile kurutma (24-48 saat) ya da dondurarak kurutma uygulanır 18, 19. Örneğin kurutulması önem- lidir. Çünkü matriksteki su ekstraksiyon verimini düşürür. Soxhlet ve süperkritik akışkan ekstraksiyonunda, yüksek miktarda suyla başa çıkmak için örneğe sodyum sülfat eklenmesi önerilmiştir20,21 . Kurutma basamağını çoğunlukla eleme (2 mm elek)22 veya örneğin 100-1000 µm aralığında bir boyuta öğütülmesi izler23 . Örneğin daha küçük boyutlara öğütülmesi (<15µm), kısaltılmış difüzyon yol uzunluğundan dolayı anali- tin partikül yüzeyine taşınmasını kolaylaştırmada avantaj sağlayabilir16. Ekstraksiyon verimi, örnek matriksinin doğasına, ekstrakte edilen analite ve analitin matriks içindeki yerine bağlıdır. Heterojen örneklerin ekstraksiyon süreci Pawliszyn tarafından 2003 yılında bir model çizilerek açıklanmıştır3 . Bu model örnek partikülünün gözenekli ve bir organik katman tarafından sarıldığını varsaymıştır. Ekstraksiyon ve analitin örnek matriksinden geri kazanımı birkaç basamakta belirtilebilir. İlk olarak analitin ekstraksiyon kabından uzaklaştırılabilmesi için, bileşik örnek matriksindeki etkin bölgelerden geri bırakılır. Daha sonra matriks- sıvı arayüzeyine ulaşabilmek için, matriksin organik kısmına doğru difüze olur. Bu safhada analit, ekstraksiyon fazına dağılır. Sonra porların içinde bulunan ekstraksiyon fazı arasından difüze olur ve taşınım yoluy- la ekstraksiyon fazı kısmına ulaşır (Şekil 3). Ekstraksiyon sürecinin son 3,17 aşaması ekstrakte edilen analitin toplanmasıdır . Şekil 3 Organik bir solvent tarafından sarılan bir toprak veya sediment partikülünün 24 genelleştirilmiş bir modeli için PLE’de ekstraksiyon basamakları .

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ DERGİSİ Ekstraksiyon sürecindeki kritik bir basamak, analitin örnek matriksi içindeki pozisyonudur. Beş farklı pozisyon olduğu varsayılmıştır (Şekil 4). 1. Matriks yüzeyine adsorbe olması 2. Bir solvent gözeneğinde çözünmesi ve/veya yüzeye adsorbe olması 3. Matriksin mikro/nano gözeneğinde çözünmesi/adsorplanması 4. Matrikse kimyasal olarak bağlanması 3 5. Ekstraksiyon solventinde çözünmesi . Ekstraksiyon sürecinde hız sınırlayıcı basamak ekstrakte edi- len matriksin doğasına bağlıdır. Doğal tortu (sediment), toprak ve çamur örneklerinin çalışıldığı çevresel uygulamalarda, solut–matriks etkileşimlerinin üstesinden gelmek zor olduğundan, yüzeyden bırakma basamağı genellikle hız-sınırlayıcı basamaktır. Bitki materyallerinde, hız-sınırlayıcı basamak daha yaygın olarak çözünme veya difüzyon 26,27 basamaklarıdır . Uygulamaları PLE, katı ve yarı-katı örneklerin ekstraksiyonu için geliştirilmiş bir tekniktir. Örnekler genellikle toprak, tortu veya gıda örnekleridir. Çoğu durumda, PLE için organik solventler kullanılır. Kritik altı (subcritical) su ekstraksiyonu veya basınçlı sıcak su ekstraksiyonu olarak adlandırılan Şekil 4 Örnek matriksinde analitin pozisyonu25

GELİŞMİŞ EKSTRAKSİYON TEKNİKLERİ I 219 teknikte, suyun ekstraksiyon solvent olarak kulanılması da mümkündür. Bir solvent olarak suyun özellikleri, yüksek sıcaklıkta ve basınçta önemli ölçüde değişir. Gıda endüstrisinin polifenoller açısından değerli yan ürün- lerinden biri, nar kabuklarıdır. Geleneksel olarak bitki materyallerinden organik solventler yardımıyla (özellikle metanol) ekstrakte edilir. Çam ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada polifenollerin ekstraksiyonu için basınçlı su ekstraksiyonu araştırılmıştır28 . Ekstraksiyon sonuçlarını etkileyen en önemli faktörlerin partikül boyutu, sıcaklık ve statik zaman olduğu bulunmuştur. Sonuçlar, basınçlı su ekstraksiyonunun gelenek- sel metanol ekstraksiyonu kadar efektif olduğunu göstermektedir. Misel ortam gibi katkılar, sıvı ve çevresel örneklerden organik kirleticilerin ekstrakte edilmesi için alternatif olarak kullanılabilir29 . Son zamanlar- da, non-iyonik yüzey aktif çözeltiler alternatif bir solvent sistemi olarak kullanılmıştır30 . Luthria ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada soya fasülyesinde isoflavonların ekstraksiyonu için sistematik bir çalışma gerçekleştirilmiştir31 . Yedi farklı solvent karışımı değerlendirilmiştir: ase- tonitril-su; etanol-su; metanol-su; dimetilsülfoksit-etanol-su; dimetilsül- foksit-asetonitril; Genapol-su. Bu değerlendirme altı farklı ekstraksiyon tekniği kullanılarak yapılmıştır: Çalkalama, vorteksleme, sonikasyon, karıştırma, Soxhlet ve PLE. Soya fasülyesi örneklerinden optimum geri kazanım dimetilsülfoksit–etanol–su (5:70:25, h/h/h) solvent karışımının kullanıldığı PLE yöntemi ile elde edilmiştir. Zhu ve arkadaşları herbisitlerin topraktan ekstraksiyonunda, kuru topraklar için ekstraksiyon verimine basıncın az etkisi olduğunu gözlemişlerdir ve 100-150°C sıcaklıkta veri- min arttığını bulmuşlardır32 . Bununla birlikte toprağın nemli olması du- rumunda 500 psi’dan 1500 psi’ya artan basınç, pestisitlerin daha iyi çözünmesinden dolayı faydalıdır33 . Bernal ve arkadaşları, sertifikalı pa- tates, havuç, zeytinyağı ve liyofilize edilmiş balık doku örneklerindeki or- ganoklorin pestisitleri ve poliklorlu bifenilleri tayin etmişlerdir. Örnekleri izole etmek için basınçlı-Soxhlet ekstraksiyonunu kullanmışlardır34 . Bu uygulamada ekstraktant olarak CO kullanılmıştır. CO ’ nin yoğunlaşması 2 2 için ekstraksiyon sistemi, soğutucu su (0°C) pompalayan sıcaklık ayarlı banyo içine daldırılmıştır.-

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ DERGİSİ Mikrodalga-Destekli Solvent Ekstraksiyonu (Microwave-Assisted Ex- traction, MAE) Mikrodalgalar yüksek frekanslı elektromanyetik dalgalardır (300-300000 MHz). Mikrodalga enerji kullanılarak ısıtmanın prensibi, iyonların iletimi ve dipol rotasyonu (dönme) yoluyla molekül üzerine mikrodalganın direkt etkisi temeline dayanır. Çoğu uygulamalarda bu iki mekanizma eş zamanlı meydana gelir. İyonik iletim, bir manyetik alan uygulandığında iyonların elektroforetik göçüdür. Çözeltinin bu iyon akışına direnci friksiyon (sürtünme) ile sonuçlanır ve böylece çözelti ısınır. Dipol rotasyonu, uygulanan manyetik alanla dipollerin yeniden düzenlenmesi anlamına gelir. Ticari sistemlerde kullanılan 2450 MHz’de dipoller düzenlenir ve saniyede 4.9×109 defa rasgele dağılır. Bu zorlanmış moleküler hareket, ısınmayla sonuçlanır2,17 . MAE’de mikrodalga ışıması, ekstraksiyon solventini ve böylece de örneği ısıtmak için kullanılır. Başarılı bir ekstraksiyon gerçekleştirmek için uygun solvent seçimi çok önemlidir. Seçilen solventlerde mikrodalga ışımasını absorplaması, sol- ventin matriksle etkileşimi ve analitin solventteki çözünürlüğü göz önüne alınmalıdır. Daha büyük dipol momente sahip olan solvent, mikrodalga ışıması altında daha hızlı ısınacaktır. Örneğin hekzan gibi nonpolar bir solvent (dipol moment<0.1) ısınmayacak, oysa 2.69 dipol momente sa- hip aseton birkaç saniye içinde ısınacaktır35 . Eğer ekstraksiyonda hek- zan ve toluen gibi nonpolar solventler gerekliyse, solventleri su meta- nol ve aseton gibi yüksek bir dipol momente sahip polar solventlerle karıştırmak önerilir. Seçilen solvent çok kuvvetli ısınmaya neden olursa, bileşiklerin degredasyonundan kaçınılamaz. Bu yüzden yaygın uygu- lama, yalnızca biri mikrodalga ışımayı absorplayan ikili karışımların (örneğin hekzan-aseton, 1:1) kullanımıdır36 . Diğer önemli faktörlerden biri de, ekstraksiyon solventi ile ekstraktın analizinde kullanılan analitik metodun uyumluluğudur. Gaz kromatografik analizler için daha az polar solventler, sıvı kromatografik analiz ve imunoassay teknikler için daha polar solventler tercih edilir. MAE’nin seçiciliği üzerine çok az literatür rapor edilmiştir. Örneğin içindeki tüm maddeler ekstrakte edildiğinden seçici bir ekstraksiyon tekniği olduğu söylenemez ve hemen hemen her durumda ekstraksiyon sonrası temizleme basamağı gereklidir35 . Ekstraksiyon genellikle kapalı bir kapta gerçekleştirilir. Bu durumda basınç artar ve solvent kaynama noktasından daha yüksek sıcaklıklara ısıtılabilir. Çoğu solvent için (aseton, aseton-hekzan, diklormetan-

GELİŞMİŞ EKSTRAKSİYON TEKNİKLERİ I 221 aseton gibi) kabın içindeki sıcaklık, solventin kaynama noktasının 2-3 katıdır. Temel olarak iki tip MAE sistemi kullanılabilir: Kapalı kap sistemi (kontrollü sıcaklık ve basınç altında) ve açık kap sistemi (at- mosfer sıcaklığında). Her iki sistem de Şekil 5’de gösterilmiştir37 . Kapalı kap sisteminde hücreler eşzamanlı olarak ışınlanırken, açık sistemde kaplar sıralı olarak ışınlanır. Açık kaplarda sıcaklık solventin atmosferik basınçta kaynama noktasıyla sınırlıyken, kapalı kaplarda sıcaklık uygu- lanan basınçla yükseltilebilir38 . Kapalı kap sistemi uçucu bileşikler olması durumunda en uygun görünmektedir. Bununla birlikte, kapalı kaplar- da, ekstraksiyon sonrasında kap açılmadan önce sıcaklığın düşmesini beklemek gereklidir. Bu ekstraksiyon süresini artırır (yaklaşık 20 dakika). Her iki sistem ekstraksiyon verimlerine göre karşılaştırıldığında, toprak örneğinden poliaromatik hidrokarbonların ekstraksiyonunda, benzer performans göstermişlerdir39 . Kapalı kap teknolojisi, PLE teknolojisiyle çok benzerdir. Her iki sistemde de solvent ısıtılır ve basınç uygulanır. Temel fark, ısıtmadadır. Biri mikrodalga, diğeri geleneksel fırın ısıtmasıdır (Şekil 6)40 . PLE’de, et- kili parametrelerin sayısı azalır. Bu nedenle bu tekniğin uygulanması pratikte daha basittir. Kullanılan ticari kapalı kap MAE sistemleri, bir manyetron tüp (çok kısa radyo dalgaları veren bir lamba), içinde döner bir tablada ekstraksiyon Şekil 5 MAE’de kapalı ve açık sistem

HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ ECZACILIK FAKÜLTESİ DERGİSİ Şekil 6 Isıtma modelleri kaplarının bulunduğu fırın, sıcaklık ve basıncın kontrolü için izleme cihazları ve birkaç elektronik bileşenden oluşmaktadırlar. Ekstraksiyon süreci, ekstraksiyon hücresine örneğin yüklenmesiyle başlar. Mikrodalga ışıma uygulanır ve solventi ayarlanan değerlere ısıtmak için, ön-ekstrak- siyon basamağı başlatılır. Bu değerlere ulaşmak için gerekli zaman hem örnek sayısına hem de örnek türüne bağlıdır. Normal olarak ısıtma 2 da- kikadan daha az bir zaman alır. Daha sonra örnek ışınlanır ve genellikle 2 10-30 dakika aralığında ekstrakte edilir . Uygulamaları MAE, sıvı örnekler için de uygun olmasına rağmen, tipik olarak katı örnekler için kullanılır. MAE uygun bir solvent seçimiyle, organik bileşikleri dekompoze etmek ve yükseltgemek için kullanılabilir. Ekstrak- 4 siyon genellikle 20-50 mL solvent gerektirir . MAE genellikle çevresel analizlerde kullanılır. Tortu ve toprak gibi matrisklerden, poliaromatik hidrokarbonlar, polikloro bifeniller ve orga- noklorlu pestisitlerin ekstraksiyonları çalışılmıştır41, 42 . Zaman, sıcaklık, basınç ve nem içeriği gibi değişkenlerin ekstraksiyon verimine etkisi araştırılmıştır. Çoğu çalışmada matriks neminin ekstraksiyon verimi- ni artırdığı bulunmuştur2, 40 . MAE gıda analizlerine de uygulanmıştır. Bouaid ve arkadaşları portakal kabuğunda atrazin ve dört organofos- forlu pestisiti tayin etmişlerdir43 . Ekstraksiyon hekzan/aseton (1:1) karışımında, 90°C sıcaklıkta, 10 dakikada ve 475 watt (w) mikrodalga

GELİŞMİŞ EKSTRAKSİYON TEKNİKLERİ I 223 gücünde yapılmıştır. Ekstraktlar gaz kromatografisi-azot-fosfor de- dektör (GC-NPD) ile analiz edilmiştir. Papadakis ve arkadaşları, susam tohumlarında 16 organoklorin insektisitinin ekstraksiyonunu MAE ile gerçekleştirmişlerdir44 . Solvent karışımı olarak su:asetonitrilin (5:95, v/v) kullanıldığı ekstraksiyon, 100°C’sıcaklıkta, 10 dakikada gerçekleşmiştir. Ekstraksiyon basamağını, ekstraktın Florisil ile temizlenme basamağı ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) ile analizi izlemiştir. Franke ve arkadaşları serumdan ilaç ekstraksiyonunda mikrodalga ışımasını kullanmıştır ve sonuçları klasik sıvı-sıvı ekstraksiyonuyla karşılaştırmışlardır45 . Model ilaç olarak lidokain, metadon, diazepam, nordiazepam, proksifen ve norproksifen test edilmiştir. Kantitasyon GC-NPD ile gerçekleştirilmiştir. Bu yöntem birkaç adli vakaya başarıyla uygulanmıştır. Desrosiers ve arkadaşları, iskelet dokularından ilaç (pen- tobarbital, ketamin, diazepam) ekstraksiyonu için MAE kullanmışlardır. Doku ekstraktları enzim-bağlı immunosorbent testi (ELISA) ile analiz edilmiştir46 . Diğer bir uygulama alanı terpenler, alkaloidler, uçucu yağlar, karetenoidler gibi doğal ürünlerin ekstraksiyonudur. Paprikada renk pigmentleri ekstrakte edilmiştir. Aseton–su (1:1, v/v) solvent karışımı kullanılarak elde edilen optimal koşullar; 120 saniye ekstraksiyon zamanı ve 50 W enerjidir. MAE koşullarında örnek sıcaklığı 60°C’nin altında tutulmuştur. Bunun nedeni daha yüksek sıcaklıkta ısıtma ka- rotenoid moleküllerinin yeniden düzenlenmesine ve toplam karotenoid içeriğinde azalmaya neden olabilir. Hidrofobik karotenoidlerin daha hidro- filik bileşiklere yükseltgenmesiyle termooksidasyon da gerçekleşebilir47 . Ayçiçeği tohumlarındaki pestisit atıklarının tayini için mikrodalga destek- li Soxhlet ekstraksiyonu kullanılarak diklormetan solventiyle hızlı bir analitik yöntem geliştirilmiştir. Ekstraksiyon verimini etkileyen mikro- dalga gücü, ışınlama zamanı, ekstraktant hacmi ve devir sayısı optimize edilmiştir. Ekstraksiyondan sonra orijinal ekstraktın lipid fraksiyonun- dan pestisit atıklarını izole etmek için, sıvı-sıvı ekstraksiyonu ve Florisil makro kolon kullanımıyla temizleme basamağı uygulanmıştır. Daha son- ra örnek GC-MS sistemine enjekte edilmiştir48 . Topraktan nitratlanmış polisiklik aromatik hidrokarbonların hızlı ekstraksiyonu için mikrodal- ga destekli Soxhlet ekstraksiyonu önerilmiştir. Işınlama gücü, zamanı, devir sayısı ve solvent hacmi, deneysel dizayn metodolojisi kullanılarak optimize edilmiştir. Nitro-poliaromatik hidrokarbonlar, amino- poliaro- matik hidrokarbonlara indirgenmiştir. İndirgenmiş analitler heptafloro- butirik anhidrit ile türevlendirilmiş ve GC-ECD ile tayin edilmiştir
…

EKTRAKSİYON

Grafiksel Çözüm

İki karışımın birbiri ile teması sonucu oluşan yeni karışımın bileşiminin saptanması Kimya Mühendisliği proseslerinde sık karşılaşılan bir durumdur. İki karışımın eklenmesiyle oluşan yeni karışımın bileşimi, orijinal karışım bileşimlerini birleştiren doğru üzerinde yer alır. Bu kural grafiksel toplam kuralı olarak bilinir. Sonuç karışımın doğru üzerindeki yerinin saptanması için ters kaldıraç kuralı kullanılır.
…