NÜKLEİK ASİTLER

DNA ve RNA olmak üzere iki grupta toplanır.

Nükleotid denilen alt birimlerden meydana gelmiştir.

NÜKLEOTİD= BAZ+ŞEKER+FOSFORİK ASİT

NÜKLEOTİDLER-NÜKLEİK ASİTLERİN YAPI TAŞLARI

Nükleotid= azotlu baz + pentoz şekeri ( 5 karbonlu) + fosfat grubu içerirler

AZOTLU BAZLAR: İKİ ÇEŞİTTİR

9 atomlu, iki halkalı pürinler (Adenin, Guanin)

6 atomlu tek halka içeren pirimidinler (Sitozin, Timin, Urasil)

A,C,G,T ve U şeklinde simgelenirler.

A,G,C DNA ve RNA’da ortak bulunur

T->DNA’da, U->RNA’da bulunur.

ŞEKER= PENTOZ

Nükleik aside adını taşıdığı şeker verir.

Ribonükleik asitlerde-RİBOZ

Deoksiribonükleik asitlerde-DEOKSİRİBOZ bulunur.

Deoksiribozun ribozdan farkı C-2’ pozisyonunda OH grubu olmamasıdır.

Nükleik Asit Kimyası

Nükleozit- baz + şeker

NMP = nükleozit + 1 PO4

NDP = nükleozit +2 PO4

NTP = nükleozit + 3 PO4

Nükleik asitlerin yapı taşıdır

özel NTPs: ATP & GTP

NÜKLEOTİTLERDE BAĞLANMA

Nükleotid yapısındaki bağlar son derece özgüldür.

Şekerin C-1’ atomu azotlu bazla kimyasal bağ yapar.

Pürinlerde N-9, pirimidin ise N-1 atomu şekerin C-1’ atomu ile bağ yapar.

Nükleotidlerde fosfat grubu, şekerin C-2’, C-3’ yada C-5’ atomu ile bağ kurar.

Bu yapı, biyolojik sistemlerde en yaygın olan ve DNA ve RNA’da bulunandır.

…

Kaynak: https://abs.mehmetakif.edu.tr/melikebaran

NÜKLEİK ASİTLER

Nükleik Asitler

DNA ve RNA nükleik asitleri oluşturur

Genetik bilginin nesiller boyu aktarılması ve bunun proteinlere tercüme edilmesinde görev alırlar

Nükleotid ünitelerinden oluşurlar

…

Nükleik asitler DNA ve RNA nükleik asitleri oluşturur. Genetik bilginin nesiller boyu aktarılması ve bunun proteinlere tercüme edilmesinde görev alırlar. Nükleotid ünitelerinden oluşurlar 1 Nükleotidler 2 Azotlu bazlar

Şekerler n RNA’nın yapısında riboz n DNA’nın yapısında deoksiriboz bulunur 2 no’lu karbona bağlı bir oksijen çıkmış 4 Baz, Nükleozid ve Nükleotid 5 Nükleotidler n Nükleotidler nükleozidlerin posfat gruplarıyla esterleşmiş halleridir n Özellikle ATP, ADP ve AMP biyolojik sistemlerde enerji taşıyıcı moleküller olarak işlev görürler

Nükleotidler Beta-N- glikozidik bağ Fosfat Baz grubu Şeker 7 Nükleotidler 8 Nükleik asitler Fosfodiester bağı RNA DNA tek zinciri

Nükleik asitlerde baz eşleşmesi n Guanin sitozinle, adenin (veya RNA’da urasil) de timinle eşleşir n Bağlanma hidrojen bağlarıyla gerçekleşir n G-C bağı A-T bağından daha güçlüdür n DNA’nın iki zincirini bir arada kalmasını sağlar 10 DNA n İki polinükleotid zinciri karşı karşıya gelir, n Bazlar arasında hidrojen bağları oluşur n Zincirler birbirine göre ters yönde yer alırlar yani birinin 5` ucuna diğerinin 3` ucu karşılık gelir n Hidrofobik ekileşimler de çift sarmalın stabilitesine ktkıda bulunur 11 DNA n DNA’nın baz dizilimi önemlidir ve canlıların tüm özellikleri bu şifrede saklıdır TGCAT 5’ fosfat ucu 3’ OH ucu

DNA DNA’sı hücre dışına dağılmış bir E.coli 13 DNA’nın 3 boyutlu yapısı 14 Ökaryotik ve prokaryotik DNA n Prokaryotlar’da DNA halkasal, ökaryotlarda ise iki ucu açık olarak bulunur. Mitokondri DNA’sı da prokaryot DNA’sına benzemektedir

DNA’nın denatürasyonu 16 DNA’nın kendini eşlemesi 17 DNA’nın kendini eşlemesi (replikasyon çatalı) DNA’nın kendini eşlemesi iki yönde birden gerçekleşir

DNA genetik bilgiyi taşır (Griffith) 19 DNA genetik bilgiyi taşır 20 DNA genetik bilgiyi taşır (Hershey)

DNA genetik bilgiyi taşır Biyokimyasal kanıtlar; n DNA’nın baz kapsamı türden türe değişiklik gösterir n Bir türün farklı organlarındaki DNA’lar aynıdır, n DNA yaş, beslenme gibi çevresel koşullardan etkilenmez, n A/T ve G/C oranı sabittir ve 1 civarındadır, n Birbirine yakın türlerin DNA’ları benzer uzak türlerin farklıdır. 22 RNA n DNA’dan farklı olarak; q Timin yerine Üridin içerir q Deoksiriboz yerine riboz şekeri içerir n mRNA, tRNA, rRNA ve ökaryotlarda snRNA olmak üzere dört farklı yapı ve işleve sahip RNA vardır n Hücrede miktar olarak DNA’dan daha fazla bulunur n Ömürleri kısadır ve sürekli sentezlenip yıkılırlar n Genellikle tek zincir halinde bulunur ama kısmen DNA gibi çift sarmallı olarak da bulunur 23 mRNA n DNA’daki genetik bilgiyi proteine taşıyan mesajcı moleküllerdir n Ökaryotlarda proteine tercüme edilmeden önce modifiye edilirler

tRNA 25 rRNA n Ribozomun %60’ı rRNA’dan oluşmuştur n Oldukça yüksek düzeyde çift sarmal yapısı gösterirler 26 Faydalı olabilecek linkler n Central dogma n DNA’nın kendini eşlemesi n DNA’nın genetik materyal olduğunun ispatı

…

Rekombinant-DNA teknolojisinin gelişimindeki önemli atlama taşları:
1953 Watson ve Crick : DNA’ nın çift iplikli
sarmal yapısı keşfedildi.
1957 Kornberg : DNA polimeraz izole edildi.
1966 Nırenberg ve ark: Genetik kod çözümlendi.
1967 Gellert : DNA ligaz izole edildi.
1972-73 Jackson ve ark : İlk r-DNA molekülü
oluşturuldu.
Boyer ve ark : Gen klonlama
tekniğinde plazmidler keşfedildi
1975 Southern : hibridizasyon tekniği
geliştirildi. ” Southern Blot ” tekniği.
Kan ve ark : ilk prenatal teşhis
1979 Goeddel ve ark: ilk rekombinant – insülin
1982 Palmiter ve Brinster : Transgenik fareler
Spradling ve Rubin : Transgenik meyve
sinekleri üretildi.
1993 Stilman ve Hall : İnsan embriyosunun
klonlanması çalışmaları
.
1997 Wilmut : Koyun klonlanması (Erişkin
memeli hücrelerinden)
1998 İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı
2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003)
DNA çipleri
Farmakogenetikte atılımlar
Kök Hücre – tedavi
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler
Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi
DNA nın Klonlanması
DNA – nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması
Nukleik asit hibridizasyonu
Genetik Mühendisliği
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler – 1
Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi

HpA I 5′ G-T-T * A-A-C 3′
3′ C-A-A * T-T-G 5′
Eco RI 5′ G *A-A-T-T-C 3′
3′ C-T-T-A-A * G 5′
Hind III 5′ A *A-G-C-C-T 3′
3′ T-T-C-G-G * A 5′
Pst I 5′ C-T-G-C-A * G 3′
3′ G * A-C -G-T-C 5′
Restriksiyon enzimleri (DNA makasları)
RFLP (Parça uzunluk polimorfizmi)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler – 2
DNA – nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması
Enzimatik Yöntem (Sanger Yöntemi)
Kimyasal yöntem (Maxam-Gilbert Yöntemi)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler- 3
Nukleik asit hibridizasyonu:

Southern transferi : DNA hibridizasyonu

Nouthern transferi : RNA hibridizasyonu

Rekombinant dna teknolojisinde kullanılan yöntemler – 4
DNA Klonlaması
Vektör kullanarak canlı hücrede
DNA çoğaltımı ;
*Plazmid
*Virus genetik materyeli
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile çoğaltım işlemi (tüpte)
Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR veya PCR)
Kalıp DNA
DNA polimeraz (Yüksek ısıya dayanıklı)
Primerler
dNTP ler ( CTP-ATP-GTP-TTP)
Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler – 5
Genetik Mühendisliği
Transgenik hayvan ve bitkiler üretmek
Transgen: Yabancı gen (veya DNA)
Transgenik: Yabancı geni taşıyan organizma
Transgenik model oluşturmak:
Hücrelere yeni gen nakli ( bir gen üzerinde değişiklik yaptıktan sonra -mutant gen- normal genin yerine sokulması) ile farklı özellikler taşıyan organizmaların üretilmesi.

Transgenik hayvan oluşturma yöntemleri;
1- Döllenmiş yumurtaya gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi

2- Embriyonik kök hücrelerine (EKH) gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi
Rec- DNA Teknolojisinin Kullanıldığı Alanlar
Rekombinant DNA teknolojisinin biyomedikal önemi
Birçok hastalığın moleküler temelini anlamak (ailesel hiperkolesterolemi, orak hücre anemisi, talessemi, kistik fibroz, müsküler distrofi)
Rec-DNA teknolojisi kullanılarak tedavi etmek (örn: insülin, büyüme hormonu, plazminojen aktivatörü)
Aşılar üretmek (hepatit B)
Tanı (AIDS testi)
Tedavi (gen tedavisi)
Prenatal tanıda
Beta thalessemia,
Duchenne müsküler distrofi,
Frajil-X sendromu
Kanser teşhisinde
retroviruslar
Onkogenler
Mutant genler
Aşı üretiminde
Yenebilir aşıların üretimi
Muz patates gibi ürünlere hepatit B, Kolera aşılarının klonlanması
“Çocuklar ölmesin
Şekerde yiyebilsinler”
Biyoteknolojik çalışmalarda
Çevre mühendisliğinde biyolojik savaş
süper bakteriler
oktan, ksilen, naftalin ve karışık hidrokarbonlar gibi petrol artıklarını kullanabilen bakteri türlerinden , tüm bu özellikleri bir arada taşıyan mikroorganizma.

Hastalıkların moleküler seviyedeki patolojik tanıları

Diyabet
ateroskleroz ve koroner arter hastalıkları
Alzheimer , şizofreni, parkinson
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 1
proteinleri kodlayan genlerde meydana gelen mutasyonlar sonucu hasarlı veya eksik protein üretimine dayanır.
Bu patolojilere göre genetik hastalıklar
Bir proteinin alt gruplarını oluşturan proteinlerde mutasyon
Thalessemia’ ler (Otosomal resesif)
Enzim hasarları
Aminoasidopatiler;Fenilketonuri, (Otosomal resesif)
Lizozomal depo hastalıkları; Tay-Sacs hastalığı
(Otosomal resesif) .
İnklüzyon –hücre hastalığı (protein trafiğindeki hata)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 2
Reseptör proteinlerindeki hatalar ve eksiklikler
Ailesel Hiperkolesterolomi (Otosomal dominant)
Transport proteinlerindeki hatalar
Kistik fibrozis (Otosomal resesif)
Yapısal proteinlere bağlı hastalıklar
Ducshenne Müsküler distrofi ( Kasta Distrophin
protein eksikliği ) (X’e bağlı)
Osteogenesis imperfecta ve Ehlers Danlos
( kollogen sentez hataları )
(Otosomal dominant)
Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 3
Nörodejenaratif hastalıklar
Alzheimer Hastalığı (Otosomal dominant veya
çok nedenli)
Büyüme veya farklılaşma proteinlerinde hasarlar
Kalıtsal meme ve ovaryum kanserleri :
( BRCA1- BRCA2 mutasyonlarına bağlı ) (otosomal dominant)
Viral ve bakteriyal enfeksiyonlarda patojenin tespitinde
Tüberküloz bakterisinin tespiti m . tuberculosis (PCR ile ) ayrıca alt tiplerinin tayini
Hepatit virusu
Herpes simplex
onko-virusların tayini
Adli Tıpta
şüpheli suçlunun tayini
veya
babalık tayini
Gen Tedavisi
AMAÇ: Mutant fenotipi düzeltmek
Gen tedavisi için kullanılan vektörler:
Viral Vektörler:
* Retroviruslar
* Adenoviruslar
Viral Olmayan Vektörler :
* Çıplak DNA (plazmid içine sokulmuş hedef DNA)
* Lipozomlar içine sokulmuş DNA paketleri
* Protein-DNA bileşenleri (hücre yüzey
reseptörlerine bağlanan protein ve DNA bileşeni)
* Yapay kromozomlar
Retroviruslar:
viral genom, konak hücre DNA’sına katılır.
Adenoviruslar:
viral genom, konak hücre DNA’sına katılmaz
kromozom dışında sitoplazmada genetik
materyal olarak bulunur.
insersiyonal mutasyona neden olmaz.
Gen transferinde çeşitli yöntemler vardır:
Rekombinant- DNA’nın lipid vezikülleri (lipozomlar) ile hücreye sokulması.
Virus genomu içine ilgili DNA parçasının sokularak tranfeksiyon
Nukleus içine mikroenjeksiyon ile rekombinant- DNA’nın sokulması.
Gen tedavisi
Vektörler iki yoldan organizmaya verilir
Ex vivo: Organizma dışına alınan mutant hücrenin düzeltilerek yeniden organizmaya verilmesi
In vivo: Dışarıda hazırlanan normal geni taşıyan vektörün organizmaya verilmesi
Gen tedavisi örnekleri
Ex vivo
SCID: Ciddi kombine immun yetmezlik hastalığı
Adenozin deaminaz (ADA ) mutasyonu
Kemik iliğinden kan kök hücreleri çıkarılır.
Sağlam gen bir vektör yardımı ile kök hücreye nakledilir.
Kök hücre organizmaya geri sokulur.
DMD : Duchen müsküler distrofi :
Distrofin proteini mutant.
Gen tedavisi örnekleri 1
Ailesel Hiperkolesterolemi ;LDLR:

Düşük dansiteli lipoprotein reseptör geninde mutasyon.
(LDLR: Karaciğerde sentezlenir )
Kalp ve damar hastalıklarına yatkınlık nedeni

LDLR- / LDLR- hastaların karaciğer hücreleri alınır,
normal gen retroviruslar ile hepatositlere sokulur,
düzeltilmiş hücreler portal ven ile vücuda verilir.

Gen tedavisi örnekleri 2
İn vivo
Kistik fibroz:
Klor kanal proteini mutant.
Adenoviruslara normal gen sokulup sprey yolu ile burun mukozasına verilir.

Klonlama
Dolly
1996 da Keith Campbell and Ian Wilmut tarfından Roslin enstitüsünde, (Edinburgh, İskoçya) da klonlandı
Mikroenjeksiyon
İnsan Genom Projesi

DNA
•Bakterilerde genetik yapı
•Birimleri nükleotidler
•Fosforik asid, deoksiriboz ve organik baz
•Purin; A, G
•Primidin; T, C
A=G A+T ≠ G+C C=T
DNA
A=G C=T A+T ≠ C+S
•A+T/C+G oranı, her canlı türü için özgül olup değişmez karakterdedir. Mikroorganizmaların sınıflandırılmasında bu özellikten yararlanılmaktadır.
•C+G/DNA molekülüne oranı birbirine yakınlık gösteren mikroorganizmalar aynı cins ve tür içine dahil edilmektedir.
RNA
—Üç tip RNA molekülü bulunmaktadır.
—Massenger RNA (= mRNA):Her biri ayrı bir protein molekülünün yapımından sorumlu genlerdeki bilginin, proteinlerin yapım yeri olan ribozomlara ulaştırılmasını sağlayan moleküldür.
—Ribozomal RNA (= rRNA): Hücredeki tüm RNA’nın %80 i rDNA yapısındadır. Bu RNA ribozomlarda protein yapılara bağlı olarak bulunur.
—Taşıyıcı RNA (=tRNA): Ortalama 80 nükleotidden oluşmuştur. Görevi sitoplazmadaki aminoasitlere bağlanıp onları aktive ederek, ribozomlara yerleşmiş bulunan mRNA’daki uygun kodonlara taşımaktadır.
—Bakterilerde Genetik Değişiklikler
—Mutasyon : DNA’daki gen yapısını oluşturan nükleotid çiftlerinin sıralanmasında veya yapısında oluşan, sentez edilecek olan proteinin yapısını ve dolayısıyla işlevini saptırıcı nitelikteki sürekli değişikliğe denir.
—Bütün canlılarda, normal olarak çok düşük oranlarda kalmak üzere, kendiliğinden mutasyonlar oluşur. X ışınları ve bazı maddeler yardımı ile mutasyon oranı arttırılabilir.

—Transformasyon : Ortamda ikinci bir canlı hücre veya bakteriyofaj bulunmaksızın, verici hücre tarafından ortama bırakılmış DNA’nın alıcı hücre tarafından kullanılarak, yeni bir hücre oluşmasıdır.
—Bunun en güzel örneği, pnömokoklarla yapılan deneylerdir. Kapsül oluşturmayan pnömokok kültürüne, kapsül oluşturma yeteneği olan erimiş pnömokok kültür ekstraktı (DNA’sı) eklendikten kısa bir süre sonra, elde edilen yeni pnömokokların, kapsül yaptıkları saptanır.
—Transdüksiyon : Bir bakteriyofaj aracılığıyla, bir bakteriden diğerine genetik madde aktarılması olayıdır. Bakteriyofajlar, nükleik materyal olarak DNA’ya sahip bakteri viruslarıdır.
—Konjugasyon : Genetik maddeyi verici ve alıcı hücrenin yanyana gelerek aralarında köprücük oluşması sonucu genetik maddenin aktarılmasıdır.
—Konjugasyonda verici DNA’sının tümünün veya bir segmentinin, bu hücrede oluşan özel
—seks pilusu aracılığıyla, alıcı hücreye direkt aktarılması olayına konjugasyon denir. Verici durumda olma yeteneği hücrede bulunan ve nakledilebilir bir genetik element olan plasmidler —tarafından tayin edilir.
PLAZMİDLER
—Bakteri kromozomundan ayrı olarak bulunan, replike olabilen, içinde bulundukları bakteriye bazı özellikler kazandıran ve bu özellikleri genetik kontrol altında tutan DNA yapısındaki elementler.
—Plazmidlerde kendi replikasyonlarını sağlayan genler ve fenotipik karakterleri yöneten bir veya daha çok sayıda genler bulunur. Bazı plazmidlerde bakteriden bakteriye kendi transferini (=naklini) sağlayan tra genleri (transfer genleri) bulunur.
—Bu özellikte olanlara konjugatif plazmidler adı verilir. Bu tür genleri içermeyenlere ise konjugatif olmayan plazmidler denir. Konjugasyon yeteneği olmayan plazmidler, ancak F faktörünün bakteride bulunması ya da konjugatif plazmidler aracılığıyla bir bakteriden başka bakteriye aktarılabilir.

—F faktörü: Bu faktör bir plazmid olup, çembersel çift iplikli DNA yapısındadır. Kromozomla
—eş zamanlı ancak ondan bağımsız olarak replike olabilme yeteneğindedir. Bu faktörü
—taşıyan bakterilere F+bakteri denir. F+ (verici) bir bakteri F- (alıcı) bir bakteri ile yan yana
—gelip aralarında köprüler oluşturarak alıcı hücreye F faktörünü veya aynı anda bakterinin
—kromozomumdan bir parçayı aktarabilme yeteneğine sahiptir
—Col plazmidleri: Bu plazmidler genel anlamda bakteriyosin yapımından sorumlu
—plazmidlerdir. Bakteriyosin, özellikle enterik bakteriler tarafından üretilen ve diğer bakteriler
—üzerine eritici etki gösteren maddelerdir.
—R plazmidleri: Özellikle Gram negatif bakterilerde antibakteriyel ajanlara karşı kromozom dışı dirençliliğin bakteriden bakteriye aktarılmasını sağlayan elementlere R plazmidleri —denir. R plazmidlerin de genellikle kendi aktarımını sağlayan rezistans transfer faktör —bulunmaktadır. R plazmidi aktarılan bakteride bir çok antimikrobik ajana karşı toplu diren砗gelişmektedir.

—Conjugation in bacteria – transfer of an F factor

—In cases where the F factor resides in the genome as an integrated copy (Hfr strain, where Hfr = high frequency recombination), then the rolling circle is the entire E. coli chromosome!

…

DNA Replikasyonu
Bölüm 12
DNA
Kendi kopyasını yapabilir, Tamir edilebilir, Rekombinasyon geçirebilir.
Tanımlar
Replikasyon orijini: Replikasyonun başlangıç noktası
Replikasyon çatalı: Kromozom üzerinde replikasyonun olduğu noktada sarmala ait zincirlerin açılmasıyla ortaya çıkan bölgedir. Önce sentezin orijin noktasında meydana gelir ve replikasyon devam ettikçe ilerler.Replikasyon çift yönlü ise, orijinden itibaren zıt yöne doğru ilerleyen iki replikasyon çatalı oluşur.
Replikon: bir orijinden bir replikasyon başladıktan sonra replike olan DNA’nın uzunluğunun bir birim olduğunu belirtmek için kullanılan terimdir.
Replikasyon orijini (prokaryotik): E. coli’de replikasyon 245 bç uzunluğunda olan ve oriC olarak adlandırılan tek bir orijinden başlamaktadır. Bakteri ve bakteriyofajlarda replikasyon tek bir noktadan başladığından kromozomun tümü replikondur. Replikasyon oriC’den heri iki yöne doğru hareket eder. Replikasyon ilerledikçe ayrı yönlere doğru birbirlerinden uzaklaşan iki replikasyon çatalı oluşur. Çatallar tüm kromozom replike olduktan sonra ter olarak adlandırılan sonlanma bölgesinde birbiriyle birleşir.
Çoklu replikasyon orijini (Ökaryotlarda)
1.Ökaryotlarda birden çok replikasyon orijini (yeast 250-400, memelilerde 25,000’den fazla replikon) bulunur.
* Daha fazla DNA içerirler (maya e.coli’den 4 kat drosophiladan ise 100 kat fazla DNA içerir)
*Ökaryotik DNA pol’ın sn’de 50 nt olan sentez hızı bakteriyal polimerazlardan 20 kat daha yavaştır. ARSs (autonymously replicating sequences-özel replike olan diziler): 11 bç. Uzunluğundaki maya replikasyon orijinidir. Sentezin etkin başlamasını sağlayan kısa dizileri içerir. 20-80 replikon kümesi sıra ile aktive olur. Polimeraz çok büyük DNA dizilimi içinde ARS dizilerini, hücre döngüsünün S fazında başlayan bir mekanizma ile bulur. Hücre döngüsünün G1 fazında tüm ARS dizilerine bazı proteinler bağlanır (mayada 6 tane) ve orijin tanıma kompleksi(Origin Recognition Complex, ORC) oluşur.
Kinazlar sentez aşamasında fosforilasyonda görev alan enzimlerdir. ORC’ye bağlanırlar ve DNA pol bağlanması için ön replikasyon kompleksi (pre-RC) oluştururlar.Kinazlar aktive olduklarında DNA sentezini tetiklerler ve her replikonda DNA sentezi tamamlanana kadar tekrar pre_RC oluşumunu engelleyerek kopyalanan ve kopyalanmamış DNA’ları birbirinden ayırırlar.
DNA Polimeraz enzimleri Bakterilerde DNA sentezinde 3 polimeraz ve diğer enzimler görev alır 1957, Kornberg ve ark. E. coli’den in vitro olarak DNA sentezini yönlendiren bir enzim saflaştırmış ve DNA polimeraz I olarak isimlendirmiştir.
İn vitro DNA sentezi için enzimin ihtiyaçları; 1.4 tip nükleotid trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP= dNTP)
2.DNA kalıbı
•4 dNTP’den herhangi biri eksik ise yada ortamda NTP’lar yerine nükleotitler ve nükleotid difosfatlar varsa sentez olmamaktadır.
•Kalıp DNA olmazsa sentez çok büyük oranda azalmaktadır. Kornberg’in izole ettiği enzim ile yapılan sentez şu şekildedir:
DNA Zincirinin Uzaması
DNA pol I’in biyolojik rolü halen şüpheli idi 1969 Delucia ve Cairns- DNA pol I aktivitesine sahip olmayan mutant bir E. coli suşu bulmuştur. Mutasyon polA1 olarak isimlendirilmiştir.
Ancak mutant suş onarım yeteneği bakımdan oldukça yetersizdir. Bu gözlemlerden sonra
Sonuç:
1. E. coli de in vivo replikasyon için en az bir pol daha olmalı
2. DNA pol I in vivo ikincil bir işlevi olmalıdır
DNA pol II ve III DNA pol ı aktivite içeren normal hücrelerden elde edilen özgün enzimlerdir.
DNA pol I, II ve III kalıptan DNA sentezi başlatamaz ve ancak primer adı verilen, var olan bir DNA zincirini kalıp boyunca uzatabilirler.
3’à5’ ekzonükleaz aktivitesi: enzimin polimerizasyonu tek yönde gerçekleştirme, bir an duraksayıp, geri dönerek ilave edilen nt’leri çıkarabilme özelliğidir. 5’->3’ ekzonükleaz aktivitesi :
DNA pol I’in özelliğidir. Enzim, sentezin başladığı uçtan itibaren nükleotitleri kesebilir ve sonra sentez yönünde işlemine devam edebilir. Bu nedenle DNApol I RNA primerini de uzaklaştırabilir. Ortamda pol III den daha fazla bulunur.
Pol Ià primeri uzaklaştırır ve oluşan boşlukları doldurur.
Pol II-> U.V hasarı nedeniyle oluşan mutasyonların tamirinde rol aldığı düşünülmektedir.
Pol III -> polimerizasyondan aslı sorumlu olan enzimdir. DNA polimeraz I’in Klenow fragmanı
DNA Polimeraz I’in 3′ à 5′ ekzonukleaz aktivitesi ile hataları düzeltmesi DNA Pol III’ün holoenzim olarak adlandırılan aktif formu, iki takım, 10 farklı polipeptit zincirinden meydana gelmiş bir dimerdir.
M. A 600.000 daltondur.
Core (çekirdek) enzim holoenzimin polimerizasyon aktivitesi gösteren kısmıdır. kompleks olarak adlandırılan ikinci bölgede 5 alt birim bulunur ve replikasyon çatalında enzimin kalıba oturtulmasında görev alır. b alt birimi, polimerizasyon sırasında enzimin kalıptan kopmamasını sağlar. P (pi), iki çekirdek polimerazın replikasyon çatalında bir arad tutunmasını sağlar.
REPLİZOM Holoezim ve diğer proteinlerin replikasyon çatalında oluşturdukları büyük kompleks.
DNA Replikasyonu Sırasında Birçok Karmaşık Olay Çözülmelidir
Priming discovery: Tuneko Okazaki: 1985
DNA Sentezi 5′ à 3′ Yönünde İlerler
Eğer zincir her zaman 5′ à 3′ yönünde ilerlerse her iki zincir nasıl aynı anda sentez edilebilir?
Bu soru 1960’larda Reiji Okazaki ve ark. tarafından çözüldü.
Okazaki fragmanları, bir DNA zincirinde sentez edilen kısa
DNA parçaları.
Leading strand (öncül zincir): 5′ à 3′ yönünde sürekli sentezin
yapıldığı zincir

…