1. GİRİŞ

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında mikroorganizmaları tanımlamak için boyama yöntemlerine sıkça başvurulur. Boyama yöntemlerinde tek bir boya kullanıldığı gibi daha sıklıkla birden fazla boya birbiri ardına eklenerek kullanılır.

Boyama işlemleri genellikle bir lam üzerinde yapılır. Kullanılacak lam, daha önceden eter-alkol karışımı ile iyice temizlenmelidir. Boyama yapılacak örnek, bir lam üzerine ince tabaka halinde yayılır. Bu örnek çeşitli vücut sıvıları ve iltihabi akıntılar olabileceği gibi, kültürde üreyen bakteriler de olabilir. Boyanacak örneğin, lam üzerine yayılmasını takiben, preparatın, havada kuruması beklenir. Boyama yöntemine başlamadan önce, lam üzerinde hazırlanan preparatın tesbit edilmesi gerekir. Tesbit işleminin amacı, lam üzerindeki materyalin lama yapıştırılmasını ve bulaşıcı olan mikroorganizmaların ölmesini sağlamaktır. Laboratuvarda, bakteriyolojik preparatların tesbitinde en sık kullanılan yöntem, ısıdır. Isı ile bozulabilecek ökaryot hücrelerden zengin örnekler ile kan ve doku preparatlarının tesbitlerinde alkol, eter, aseton gibi maddelerden yararlanılır. Tesbit işlemi için preparatın alevden üç kez geçirilmesi, %95 alkolde veya eşit miktar alkol-aseton karışımında 10-20 dakika süre ile tutulması yeterlidir.

Lam üzerine yayılan örneğin tesbitinde neler kullanılır?

Tesbit işlemindeki amaç nedir?

2. MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN BOYALAR VE BOYAMA YÖNTEMLERİ

2.1. Mikroskobik Preparatların Hazırlanması

Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla hem boyamadan direkt mikroskopta hem de boyanarak incelenmeleri gerekir. Bu yöntemlerle mikroorganizmaların hareket, spor, kapsül, boyanma varlığı ve şekli gibi özellikleri araştırılır. Bu amaçla kültürlerden veya hastalık örneklerinden kurallara uygun preparatlar alınarak hazırlanır ve incelenir. İncelemeler çok yönlü olduğundan, hazırlanacak preparatların da inceleme bakımından çeşitli ayrıcalıkları olmaktadır.

2.2. Boyanma ve Boyalar

Boyama, mikrobiyolojik tanıda yardımcı bir yöntemdir. Boyanma, kimyasal bir olaydır. Boyalar genellikle tuz yapısındadırlar ve pH’larına göre asidik, bazik, nötral olabilirler. Mikrobiyolojide, daha çok bazik ve nötral boyalar kullanılır. Bazik boyalar, renkli katyon ve renksiz anyon içerirler. Bazik boyalara, metilen blue+ chloride– ve kristal viyole (Hexamethyl-p-rosanaline+ chloride–) örnek olarak verilebilir. Bu iki örnek boyanın renkli katyon kısımları, pozitif yüklü metilen mavisi ve rosanaline’dir. Bakteri hücresi, nükleik asitten zengin fosfat grupları nedeniyle negatif yüklüdür. Bu nedenle bakteri hücreleri bazik boyalar ile iyi boyanırlar. Asidik boyalar renksiz katyon içerirler ve bakterileri boyamazlar. Zemin boyamada ya da asit pH’lı ortamlarda kullanılırlar.

Nötral boyalara örnek, Giemsa ve Wright verilebilir. Bu boyalar, özellikle kan ve doku preparatlarının boyanmasında, kanın şekilli elemanları, hücreler ve bazı parazitlerin daha etraflıca gözlenmelerinde üstündür. Boyama işlemlerinde tek bir bazik boya kullanılmışsa, basit boyamadan söz edilir. Metilen mavisi, en çok kullanılan basit boyama yöntemidir. Birden fazla bazik boya kullanılarak, çeşitli mikroorganizmalar, farklı renkte boyanırlar. Birleşik boyama yöntemlerine örnek olarak Gram ve Aside-Alkole Rezistan Boyama (ARB veya AARB) verilebilir.

Bakteri hücresi boyayı nasıl alır?

Boyalar pH’larına göre kaça ayrılırlar?

Birleşik boyamanın özelliği nedir?

2.3. Gram Boyama Yöntemi

1884 yılında Danimarkalı Bakteriyolog Christian Gram tarafından tarif edilmiştir. Gram boyası ile mor renk alan bakteriler Gram pozitif (+) veya Gram olumlu, kırmızı renkte boyanan bakteriler ise, Gram negatif (–) ya da Gram olumsuz olarak adlandırılırlar.

Basillerin yaklaşık yarısı, kokların büyük kısmı ve mantarlar, Gram olumludurlar. Spiral şekilli bakteriler ise Gram negatiftirler.

Gram (+) pozitif veya Gram (–) negatif olsun kristal viyolet boyası ile tüm bakteriler mor renge boyanırlar. Ortama eklenen lugol solusyonu ile Gram (+) bakterilerin oluşturdukları yapı, daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilemez. Oysa Gram (–) bakterilerin kristal viyole + lugol karışımları alkol ile giderilebilir. Bir başka deyişle, boya, bakteri hücresinden dışarıya salınır (dekolorizasyon). Gram (–) negatif bakterilerin, alkolle renkleri gittiğinden, ortama daha sonra eklenen sulu füksin ile boyanır. Böylece Gram (+) bakteriler mor renkte (kristal viyole rengi), Gram (–) bakteriler kırmızı – pembe renkte (sulu fuksin) boyanırlar. Gram boyanma özelliği bakteri duvar yapısı ile ilgilidir. Bakteriye Gram (+) boyanma özelliği veren Gram negatif ve Gram pozitif bakteri duvar ince yapıları Şekil 1 de gösterilmektedir.

Gram Boyama Yönteminde Aşağıdaki işlemler Sırasıyla Uygulanır:

Havada kurutulup alevde tesbit edilmiş preparat üzerine,
■ Kristal viyolet damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Preparat su ile yıkanır.
■ Lugol damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Su ile yıkanır.
■ Alkol ile renksiz sıvı akana kadar renk giderilir. Su ile yıkanır.
■ Sulu füksin damlatılır, 30 saniye beklenir. Su ile yıkanır.

Kurutma kağıdı arasında hafifçe bastırılarak kurutulur. 100’lük büyütmeli objektif ile immersiyon yağı damlatılarak incelenir.

Gram olumlu ve olumsuz bakteriler hangi renkte görülür?

Gram olumsuz bakteriler neden mor renkte boyanmazlar?

Gram boyamada dekolorizasyon (renk giderme) hangi madde ile yapılır?

Tüberküloz basili ve benzer özellikteki bakteriler bazik boyalar ile diğer bakteriler gibi kolayca boyanmazlar. Bakteri duvar yapısının özelliği nedeniyle bazik boyalar ısıtılarak ve daha uzun süre bekletilerek hücre içine alınabilirler. Boyayı aldıktan sonra, ortama eklenen alkol ve asit karışımı ile renkleri giderilemez. Oysa diğer bakterilerin asit + alkol karışımında renkleri gider ve zemin boyamak için kullanılan boyanın rengini alırlar. Bu nedenle, bazı bakterilerin mikroskobik incelemelerinde asit ve alkole dirençli boyama yöntemlerine başvurulur. Ehrlich Ziehl-Neelsen metodu, ARB yöntemlerinden en sık kullanılanıdır. Tüberküloz, lepra basili, nokardialar ve diğer mikobakteriler ARB ile boyanırlar. Tüberküloz hastalığının tanımlanmasında, özellikle balgam başta olmak üzere çeşitli vücut ve sıvı örneklerinden, basil aranmasında değerli bir boyama yöntemidir.

ARB Yönteminde aşağıdaki işlemler sırası ile uygulanır :

Havada kurutulup alevde tesbit edilen preparat üzerine :
■ Karbol füksin damlatılır. Kaynatmamaya özen göstererek preparat alttan 2-5 dakika süre ile ısıtılır. Boya azaldığında tekrar damlatılarak eklenir. Kurumamasına özen gösterilir. Su ile yıkanır.
■ Asit alkol karışımı ile renk giderilir. Su ile yıkanır.
■ Metilen mavisi ile 1 dakika boyanır. Su ile yıkanır. Boyanan preparat üzerine bir damla immersiyon yağı damlatılarak x 100 büyütmeli objektif ile mikroskopta incelenir. Sonuçta asidoresiztan bakteriler, mavi zeminde kırmızı renkte görülürler.

Aside dirençli boyama için Kinyoun ve Fluorochome yöntemleri de kullanılır.

ARB yöntemi ile boyanan bakterilere örnekler veriniz.

Tüberküloz basili ARB yönteminde ne renkte boyanır?

2.4. Bakteriyolojide Kullanılan Diğer Boyama Yöntemleri

2.4.1. Metilen Mavisi İle Boyama

Bu amaçla en sık Löffler’in metilen mavisi kullanılır. Boyama işlemi için hazırlanan yayma havada kurutulur ve alevden geçirilerek tesbit edildikten sonra üzeri metilen mavisi ile örtülür. Yayma 30-60 saniye arasında boyayla temas ettirilir. Eğer daha uzun süre temas olursa, bakteriler ile diğer cisimlerin ayırt edilmesi güçleşir. Suyla yıkanıp, havada kurutulan yayma preparat immersiyon objektifi ile incelenir.

2.4.2. Kapsüllerin Boyanması

Kapsül ya boyanarak ya da zemin ve bakteri gövdesinin boyanması sonucunda boyasız bir bölge olarak gösterilebilir. Kapsülü, boyanmayan boşluk görünümünde incelemek için, en sık kullanılan boya çin mürekkebidir. Bu mürekkepten temiz bir lam üzerine bir damla konur. İncelenecek örnek veya kültürden aynı miktarda alınarak karıştırılır. İnce yayma yapar gibi bir lam yardımı ile yayılır. Yaymada kapsüller, siyah zemin üzerinde renksiz olarak görülürler. Kapsülün boyanarak incelenmesinde Muir veya benzeri yöntemler kullanılır. Bu boyama sonucunda kapsüller mavi, hücreler kırmızı renkte görülürler.

2.4.3. Sporların Boyanması

Modifiye Wirtz yöntemi kullanılabilir. Bu yöntemle sporlar yeşil, hücreler kırmızı görülür. Sporlar Gram boyasını almazlar. Sporlar, bakterilerin içerisinde boyanmayan boşluklar şeklinde görülürler. Sporları boyayarak gösterebilmek için Modifiye Wirtz yöntemi kullanılabilir.

Ayrıca bakterilerin hücre içi vakuollerini, kirpiklerini, metakromatik cisimciklerini boyamada kullanılan özel yöntemler vardır. Sayılan yöntemler ve diğer birçok boyama işlemlerinin amacı direkt mikroskobik incelemelerde mikroorganizmalara ait özel yapıların gösterilebilmesidir. Bu çalışmalar, tanımsal ve aynı zamanda araştırma amaçlıdır.

2.4.4. Mantar Boyaları

Maya ve maya benzeri mantarlar, bakteri boyalarıyla (özellikle Gram yöntemi) kolayca boyanabilirler. Küf biçiminde üreyen mantarların tanımlanmasında ise bazı özel boyalar kullanılır. Bu boya ve maddeler şunlardır:

■ Laktofenol pamuk mavisi : Laktik asit, fenol, gliserin ve pamuk mavisinin distile sudaki karışımıdır. Hif yapılarının ve sporların daha iyi görülmesini sağlar.

■ KOH : %4-10-30’luk sulandırımları kullanılır. Dokudan hazırlanan direkt preparatlarda kitin ve mukus dokusunun parçalanmasını sağladığından mantar elemanlarının daha kolay bir biçimde açığa çıkmasını sağlar. Özellikle deri, saç ve tırnağın mantar infeksiyonlarının tanımlanmasında kullanılır.

Kapsül ve sporların varlığının gösterilmesinin önemi nedir?
Deri kazıntıları, saç ve tırnak örneklerinin potasyum hidroksit ile karıştırılmasındaki amaç nedir?

2.4.5. Virus Boyaları

Viruslar ancak elektron mikroskobu ile görülebilecek boyutlardadır. Elektron mikroskobik incelemeler için preparat hazırlanması özel teknikleri ve bu konuda deneyimli personeli gerektirir. Virusların üremeleri sonucunda hücre içerisinde oluşturdukları inklüzyon cisimcikleri ışık mikroskobunda özel boyalarla boyandığında gözlenebilir. Bu amaçla en çok kullanılan boyalar Giemsa ve Wright’dir. Kuduz virusunun beyinde oluşturduğu ve Negri cisimciği olarak anılan yapılar, Seller metodu ile boyanır. Bu boyama ile Negri cisimcikleri parlak vişne renginde, çekirdek maddeleri koyu mavi, sinir hücreleri mavimsi renktedir. Viruslar ayrıca hücre kültürlerinde üretilerek, gerek hücrelerde oluşturdukları değişiklikler gerekse oluşturdukları inklüzyon cisimleri çeşitli boyalar kullanılarak incelenebilir.

Işık mikroskobunda viruslara ait gözlenen oluşumların adı nedir?

Negri cisimciği nedir?

Ayrıca daha özel amaçlarla kullanılan boyalar da vardır. Bunlar;
PAS (Periyodik Asit Schiff)
Gomori metanamin silver boyası
Hematoksilen-eozin boyası
Papanicalou direkt yayma boyası
Sözü edilen bu boyama yöntemleri patoloji dersleriniz içerisinde geçecektir.

2.4.6. Parazit Boyaları

Dışkının parazitolojik açıdan mikroskobik olarak incelenmesi boyalı ve boyasız olarak yapılır. Boyasız preparatların hazırlanmasında serum fizyolojik kullanılır. Ayrıca biyokimyasal incelemeler için çeşitli boya ya da kimyasal maddelerden yararlanılır.

Serum fizyolojik ile inceleme: Lam üzerine bir damla serum fizyolojik konur. Temiz bir tahta çöp yardımı ile bir parça dışkı alınarak serum fizyolojik ile karıştırılıp, süspansiyon haline gelmesi sağlanır. Daha sonra üzerine lamel ile kapatılarak ışık mikroskobunun önce 10’luk, daha sonra 40’lık objektifleriyle incelenir. Bu yöntemde boya kullanılmadığından protozoonların insanlarda hastalık yapan hareketli trofozoit şekillerini görmek mümkün olur.

Boyalı inceleme: Bu amaçla kullanılan başlıca boyalar eozin ve lugol’dür. Bu metodlar ile dışkıda parazit yumurtaları, kistleri ve larvalarının ince yapılarının görülmesi mümkündür.
Eozin boyası: Eozinin serum fizyolojik içindeki %0,1’lik sulandırımından bir kaç damla taze dışkı üzerine eklenir. Lamel ile kapatılır. Zemin kırmızı, parazit yumurtaları ise soluk pembe boyanır.
Lugol: Potasyum iyodür ile iyot karışımı olan lugol solusyonu taze dışkı preparatı üzerine 1 damla damlatılır ve lamel ile kapatılır. Parazit yumurtaları sarı-kahverengi olarak boyanırlar.

Dışkının parazitolojik incelenmesinde santrifüj ve diğer yöntemlerle yoğunlaştırma işlemi yapılarak parazit elemanlarının görülme oranı arttırılabilir.

…

Kaynak: https://munzur.edu.tr/birimler/akademik/yuksekokul/syo/bolumler/fizik/Pages/file/Mikro06.pdf

Mikrobiyolojik Ekim, Sayım ve Boyama Yöntemleri

MİKROORGANİZMA EKİM YÖNTEMLERİ ve SAYIMI:

Tanım: Gıda maddesi üzerinde bulunan mikroorganizmaların sayılarının belirlenmesi amacıyla yapılan ekim işlemidir.

Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi: Bir gıda maddesinde mikroorganizma sayısı belirlenerek o gıdanın gıda tüzüğünde belirtilen değerlere uygunluğunun saptanarak, sağlıklı olup olmadığı belirlenir.

Gıda Örneklerinde Toplam Bakteri Sayımı:

Özet: Bu yöntem fermente gıdalar gibi doğal niteliği yönünden yüksek sayıda mikroorganizma  içerenler dışında bir çok gıdada kalite kriteri olarak kullanılır. Yöntemlerde belirtilen besi ortamlarına ekilen gıda örneği seyreltimleri belli süre ve sıcaklıkda, aerobik koşullarda inkübe edilir. Toplam bakteri sayımında, dökme ve yayma plak teknikleri gibi kültürel sayım yöntemleri kullanılır.

1. Dökme Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:

Materyal:

• Mikroskop

• Otoklav

• Etüv(220°C’ye kadar ayarlanabilir)

• Su banyoları

• Stomacher veya blender

• Bunzen beki

• Steril pens

• Tüp karıştırıcı

• Steril drigaski , özeler

• Cam veya plastik steril petriler

• Steril pipetler

• Deney tüpleri ve tüp taşıyıcıları

• Erlen, beher

• Plate Count Agar(PCA),EMB

• Mercimek

Metot:

      10g gıda maddesi tartılır ve 90ml fizyolojik su içine konur. Bu karışım stomacher’de homojenize edilir. Bu dilisyon  –1 dilisyonudur.

      –1 dilisyonundan  1ml alınır ve içinde 9 mlt fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –2 dilisyonudur.

      –2  dilisyonundan 1 ml alınarak içinde 9 ml fizyolojik su bulunan deney tüpüne aktarılır. Bu –3 dilisyonudur.

      Üzerlerine seyreltim değerleri yazılmış petri kutularına –1,-2,-3 dilisyonlarından 1’er ml konulur. Petriler üzerindeki numaralar seyreltim numaraları  ile aynı olmalıdır.

      Agarlı besi ortamı kaynar su banyosunda 45°C’ye kadar soğutulur. Her petriye 15-20 ml besi yeri dökülür.

      Petrilere hafif salınım hareketi verilerek örnek ile besi yerinim karışması sağlanır.

      Besi ortamı katılaştıktan sonra  petriler ters çevrilerek 25°C’ de 24-48 saat inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:

• Plate Count Agar (PCA):

• Trypton 5 gr

• Yeast agar 2,5 gr

• Glukose 1 gr

• Agar 15 gr

• Destile su 1 lt

• Eosin Methylen Blue Agar (EMB):

• Pepton 10 gr

• Laktoz 10 gr

• K₂HPO₄ 2 gr

• Agar 15 gr

• Eosın Y 0,4 gr

• Methylen Blue 0,065gr

• Destile su 1 lt

2. Yayma Plak Yöntemiyle Toplam Bakteri Sayımı:

Materyal:

Gerekli cihaz ve malzemeler  dökme plak yönteminde anlatıldığı gibidir. Yalnız burada besi yeri olarak DRBC agar kullanılır. Bu besi yeri ile küfler sayılır.

Metot:

      –1,-2,-3 dilisyonları daha önce anlatıldığı gibi hazırlanır.

      Boş petrilere 15-20 mlt besi yeri dökülür. Besi yerinin donması beklenir ve üzerine her dilisyondan  0,1 er  mlt  pipetle aktarılır.

      Petrilere 0,1 er mlt örnek koyulduğu için bir kez daha seyreltim yapılmış gibi sayılır ve petrilere koyulan seyreltim derecesinden bir düşük sayı ile numaralandırılır:-1® -2

      Koyduğumuz örnekleri drigaski ile agarın yüzeyine yayarız.

      25°C de 5-7 gün inkübe edilir.

Kullanılan Çözeltiler:

• DRBC Agar:

• Glukoz 10 gr

• Bakteriyolojik pepton 5 gr

• KH₂PO₄ 1 gr

• MgSO₄.7H₂O 0,5 gr

• Rose bengal 0,5 mlt

• Dikloran 1 mlt

• Kloram fenikol 0,1 gr

• Agar 15 gr

• Damıtık su 1000 mlt

3. Direkt Ekim Yöntemi:

Materyal:

• Malt Extract Agar(MEA)

• Nohut

• Diğer materyaller daha önceki yöntemlerde kullanılan materyallerdir.

Metod:

      Behere 50 gram nohut konur. Üzerini kaplayacak kadar %4’lük NaOCl ile 1 dakika boyunca çalkalanır.

      Daha sonra bu çözelti dökülüp nohutlar beher içinde steril su çalkalanır.

      Steril su dökülüp tekrar steril su eklenir, çalkalanır ve dökülür.

      Beş adet nohut steril bir pensle alınıp dikkatli bir şekilde besi yerine konulur. Nohutların petri kutusu içinde kaymamasına, birbirlerine değmemesine ve besi yerinin nohutlar dikilirken yırtılmamasına özen gösterilmelidir.

Kullanılan Maddeler:

• Malt Extract Agar:

• Malt Extract 30g

• Agar 20g

• Destile su 1 lt

Mikroorganizma sayısının belirlenmesi:

Petri kutusunda sayım yaparken bakteriler ve mayalar için 25-250 koloni gelişmiş petriler seçilirken, küfler için ise 10-25 koloni gelişen petriler seçilir. Mikroorganizma sayısı aşağıdaki formül ile bulunabilir:

Mos. sayısı (cfu/g) = Petrideki koloni sayısı * petri kutusuna ekilen miktar (ml) /seyreltme oranı

 Hata Kaynakları:

• Dökülen besi yerlerinin petri kutusuna iyi dağıtılamaması.

• Katı parçacıklar bulunan besi yeri dökülmesi.

• Yeterli seyreltme yapılamaması.

• Sayım yaparken dikkat edilmemesi.

BOYAMA YÖNTEMLERİ ve MİKROORGANİZMALARIN BOYANMASI:

Tanım:

Mikroorganizmaların pek çoğu renksiz olduklarından normal ışık mikroskobu ile görülmeleri zordur. Mikroorganizmaların mikroskopta görünür hale getirilmesi için preparat hazırlandıktan sonra uygun boya çözeltileriyle boyanmaları işlemine “mikroorganizmaların boyanması”denir.

Boya bir benzen halkasına bağlı kromofor ve okzokrom gruplarını taşıyan organik bir bileşiktir. Kromofor grup moleküle renk özelliği verir, ancak bu bileşik renkli olmasına rağmen henüz boya karakterinde değildir. Bu maddenin herhangi bir ortama tutunma özelliği yoktur. Bu özellik okzokrom grubu ile sağlanır. Okzokrom grubu moleküle elektrolitik çözünme özelliği vererek tuz meydana getirilmesini sağlar. Okzokrom grubu boyanın renk tonunu değiştirebilir. Ancak rengin ortaya çıkmasını sağlayamaz.

Boya Çeşitleri:

• Bazik Boyalar: Bazik fuksin, Kristal violet, Metilen mavisi, Safranin.

• Asit Boyalar : Nigrosin, Eosin, Asit fuksin.

• Nötr Boyalar : Giemsa, Leishman

Gıda Bilimi ve Endüstrisi ile İlişkisi:

Boyama yöntemleri ile mikroorganizmaların sınıflandırılması ve tanımlanması, genel olarak şeklinin gözlenmesi mümkündür. Boyama ile bir gıda ürününün ekim işleminden sonra açığa çıkan kültürlerden şüphe duyulanların hangi mikroorganizmalar olduğu belirlenir. Böylece insan sağlığı açısından güvenilir bilgiler elde edilebilir. Ayrıca boya maddeleri mikroorganizmaların boyanmasının dışında başka amaçlar için de  kullanılmaktadır. Örneğin trifenil içeren bazı boyalar bazı mikroorganizmalar üzerine öldürücü etkiye sahip olduklarından, mikroorganizmaların izolasyonunda besi yerine inhibitör ajan olarak ilave edilmektedir. Böylece istenmeyen mikroorganizmaların gelişmesini önleyerek besi yerine seçici özellik kazandırır.

Boyama Yöntemleri:

• Basit Boyama

• Gram Boyama

• Endospor Boyama

• Flagella Boyama

• Kapsül Boyama

• Küf Boyama

1. Gram Boyama

Tanım:

Mikrobiyolojide çok kullanılan bir yöntemdir. Bakteriler bu yöntemle iki gruba ayrılırlar. Mor-menekşe renge boyanmış mikroorganizmalar gram pozitif, pembeye boyananlar ise gram negatif olarak tanımlanırlar. Bazı mikroorganizmaların yaşlandıkça gram reaksiyonlarında değişiklik olabileceğinden 18-24 satlik genç kültürlerden hazırlanan preparatlar kullanılmalıdır.

Materyal:

• Lam

• Öze

• Besi yerinde bakteri kültürü (PCA petrisinde)

• Boya çözeltileri: Crystal violet, gramın iyot çözeltisi, safranin veya sulu fuchsin

• %95’lik etil alkol

• Kurutma kağıdı

• İmmersiyon yağı

• Mikroskop(100Xobj.)

Metod:

1. a) Preparat Hazırlanması:

      Temiz bir lam üzerine öze ile bir damla steril fizyolojik tuz çözeltisi damlatılır.

      Öze bunzen alevinde sterilize edilir,soğuması için kısa süre beklenir.

      Steril öze ile katı besiyerinden bir miktar kültür alınır.

      Kültür lam üzerine damlatılmış su ile karıştırılır.

      Öze bunzen alevinde sterilize edilip,yerine konur.

      Preparatın kuruması için bir süre beklenir.

      Bir pens yardımıyla bir ucundan tutulan lam bunzen  aleviden  3 kere geçirilir.

1. b) Boyama Yöntemi:

      Uygulamada hazırlanan preparat üzerine crysal violet damlatılarak 1-2 dak. beklenir.

      Su ile hafifçe yıkanarak boyanın fazlası akıtılır.

      Lugol çözeltisi damlatılarak 1 dak. bekletilir.Sürenin sonunda Lugol çözeltisi akıtılır.

      Preparat %95’lik etil alkol ile yıkanır.(10-15 sn )

      Preparat, saf sudan geçirildikten sonra sulu carbol fuchsin çözeltisi ile 10-30 saniye boyanır.

      Damıtık su ile iyice yıkanır ve kurulama kağıdı ile hafifçe suyu alınır ve kurumaya bırakılır.

      İmmersiyon objektifi ile mikroskopta incelenir.

Kullanılan çözeltiler:

• Crystal Violet Çözeltisi:

• Crystal Violet 50 g

• Damıtık Su 00 ml

• Lugol çözeltisi

• İyot 00 g

• KI 00 g

• Damıtık Su 00 ml

• Carbol Fuchsin (Ziehl-Neelsen)

• Basic fuchsin 00 g

• Etanol (%95) 00 ml

• Fenol (%5’lik çözeltisi suda) 00 ml   

2. Küf Boyama:

Materyal:

• Lam

• Öze

• Küf kültürü

• Lactofenol

• %95’lik etil alkol

• Kurutma kağıdı

• İmmersiyon yağı

• Mikroskop

• Lamel

Metot:

      Temiz bir lam üzerine bir damla lactofenol çözeltisinden damlatılır.

      İğne uçlu öze ile spor yapısını içeren kültür bir miktar besiyeri ile birlikte alınarak çözelti üzerine konur.

      Üzerlerine bir damla alkol damlatılıp hava kabarcığı kalmayacak şekilde lamel kapatılır.

      Preparat mikroskopta incelenir.

Kullanılan Çözeltiler: 

• Lactofenol Çözeltisi:

• Fenol (kristal) 20 g

• Laktik Asit 20 g

• Gliserol 40 g

• Saf su 100 ml

Hata Kaynakları:

• Yeterli steril koşullarda çalışmama.

• Besi yerinden kültür alımına dikkat etmeme.

• Preparat alınırken kültürün lam üzerindeki su ile iyice karıştırılmaması.

• Mikroorganizmaların lam üzerine iyice fiksasyon edilmemesi.

• Damlatılan boyaların gereğinden fazla veya az damlatılması.

• Bekleme sürelerinin yeterli olmaması.

• Su ile yıkamada mikroorganizmaların kayıp olması.

• Kurutma kağıdının fazla bastırılması.

• Küf boyamada lamelin hava alacak şekilde kapatılması.

Ekler:

→Gıdadaki mikroorganizmaların tüm yüzeye yayılması için parçalama işlemi yapılır. Bu işleme homojenizasyon denir. Homojenizasyonda üç tip alet kullanılır:

–Stomacher: Dilüsyon sıvısı  içinde bulunan maddeyi pedalları ile döverek parçalayıp sıvıya homojen olarak dağıtan alettir.

–Blender: İçinde bulunan bıçağın dönmesi sonucu homojenizasyon sağlayan alettir.

-Top drive homogenizer: Bıçağın üstten aşağıya dönerek inmesiyle homojenizasyon sağlayan alettir.

Gram pozitif bakterilerin alkol ile muameleden sonra crystal violet-iyot kompleksini bırakmamalarının nedeni hücre duvarının özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Gram-negatif bakterilerde ince bir peptidoglycan tabaka bulunur ve yağ oranı daha fazladır. Gram-pozitif bakterilerde ise peptidoglycan tabaka daha kalındır. Gram boyamanın uygulanmasından sonra oluşan crystal violet-iyot kompleksi, alkol ile yıkamada gram pozitif bakterilerde kalın peptidoglycan tabakadan çıkamaz ve hücre içinde kalarak hücrenin mor renkte görünmesine neden olur. Gram negatif bakterilerde ise alkol, hücre duvarının dışındaki lipopolisakarid tabakada delikler oluşturur. Böylece alkolden sonraki su ile yıkamada boya yıkanır ve gram negatif bakteriler başlangıçtaki şeffaf durumlarına dönerler. Bu aşamadan sonra bakteriler karşıt boya olan safranin ile boyandıklarında boyayı tuttukları için renkleri pembe-kırmızı görünür. Gram pozitif bakterilerde safraninin bir etkisi olmadığı için hücrenin renginde son olarak bir değişiklik  meydana gelmez.

Sonuçlar ve Bulgular:

Dökme plak – PCA: 46.10²

                        EMB: 1.10²   

Yayma plak – DRBC: 2.10⁴

Direk ekim – MEA: Oğuzhan – %60

                                 Nükhet    – %80

                                 Serli        – %100

                                 Serpil      – %100

  Referanslar:

      HEPERKAN, D. 1998, Gıda Mikrobiyolojisi Ders Notları, İstanbul

      Gıdalarda Temel Mikrobiyolojik Analiz Yöntemleri, Tübitak

      GÜRGÜN,V.; A.K. HALKMAN. 1998 Mikrobiyolojide Sayım Yöntemleri. Gıda Teknolojisi Yayınları, Yayın No:7, Ankara

1. PREPARAT HAZIRLAMA

Mikroskopta incelenmeye hazır hale getirilmiş numuneye “preparat” denir. Preparata boyama işlemi yapılırsa bunlar boyalı preparat olarak belirtilir. Mikroskobik inceleme amacı ile şüpheli kültürlerden veya marazi maddelerden (organlardan, patolojik sıvılardan, kandan, idrar, gaita, sperma, süt vb.) prepaıatlar hazırlanır. Lamın üstüne kültür veya numuneden konulup lamel kapatılarak yayma, kurutma, fıkse etme gibi işlemler yapılarak preparat hazırlanır.

Preparat hazırlamada kullanılacak lamların kalitesi (şeffaflığı, yüzeylerinin çiziksiz olması, kenarlarının ve ölçülerinin düzgünlüğü, kalınlığının homojenliği ve camın sağlamlığı) ve temizliği son derece önemlidir. Lam üzerinde bulunan çok küçük bir leke, toz, kalıntı veya çizik mikroskopta yanlış algılamalara neden olabilir ve görüntünün net olarak görülmesini engelleyebilir.

1.1. Lamların Temizlenmesi

Yeni hiç kullanılmamış lamların yüzeylerinde parlak görünmesi amacıyla kullanılan bazı kimyasal maddeler vardır. Lamlar temizlenerek bu kimyasallar uzaklaştırılmaz ise lam üzerine yayılan numunenin lama tutunması (yapışması) azalır. Yıkama sırasında numune lamdan ayrılır veya aralarda boşluklar oluşur. Bu nedenle, hiç kullanılmamış yeni lamların da kullanılmadan önce yıkanması ve temizlenmesi gerekir.

Hiç kullanılmamış (yeni) lamların temizliği toplu olarak yapılacaksa kromik asit çözeltisinde bekletilerek, tek tek veya kullanılacağı anda yapılacaksa % 96’lık etil alkol – eter (1:1) karışımı ile yapılmaktadır.

Hiç kullanılmamış (yeni) lamların kromik asit çözeltisi ile temizliğinin yapılışı:

> Lamlar, birbirine temas etmeyecek şekilde ızgaralara yerleştirilir.

> Kromik asit çözeltisinin bulunduğu kaba konularak 12 saat bekletilir.

> Lamlar, kromik asit çözeltisinden alınarak musluk suyu altında iyice durulanır.

> Saf su ile son durulama yapılır.

> Yumuşak dokulu, temiz ve kuru pamuklu bir bezle veya kâğıtla silinir.

…

Kaynak: http://gida.erciyes.edu.tr/dosyalar/dokumanlar/DUYGU-EL%C4%B0F/genel%20mikrobiyoloji%20lab%20dersi/boyama%20y%C3%B6ntemleri.pdf