Numune hücresinde bulunan geçirgen bir numune çözeltisi içinden bir ışın demetinin geçtiğini düşünelim. Işının bir bölümü dosdoğru geçecek ve bir kısmı da çözelti tarafından soğurulacaktır. Geçen ışının yüzdesi Geçirgenlik ve bu miktarında -log ‘ sı Absorbans olarak bilinir.

Hangi Faktörler soğurma miktarını kontrol eder?

Numune tarafından gösterilen 3 faktör soğurma miktarını etkiler.

1. Numune çözeltisi (veya kabı) ne kadar kalın ise soğurma miktarı o kadar fazla olur.

2. Numune çözeltisi ne kadar derişikse (daha fazla molekül daha fazla soğurma) veya kalın ise soğurma miktarı o kadar fazla olur.

3. Eğer aynı dalga boyunda soğurum yapan iki farklı molekül varsa bunlardan sadece biri daha fazla soğurum yapar. Çünkü bazı moleküller belli dalga boylarında diğerlerinden daha iyi soğurma yapar.

Lambert-Beer yasası bütün bunları tek bir denklem haline getirmiştir. Bunlar;
Konsantrasyon (c), Numune kalınlığı (veya ışık yolu uzunluğu) (I), Soğurum kapasitesi (molar absorptivite)’ dir.

Molar absorptivite analiz duyarlılığının bir ölçüsü olarak alınabilir. Çünkü ışını soğuran ne kadar molekül varsa tayin edilecek madde miktarı o kadar azalır.

Kantitatif (nicel) Çalışma

Nicel ölçümler Lambert-Beer yasası ile absorbans X konsantrasyon kalibrasyon grafiğinin kullanımını içerdiğinden doğrusal bir grafik elde edilmelidir. Analizin yapılacağı bir dalgaboyu ile absorbans spektrumunda bir maksimum seçilmesi genellikle iki nedenden dolayı seçilir:

En yüksek tepe noktası molar absorptivitenin en yüksek olduğu değeri gösterir ve dolayısıyla bu değerde analizin duyarlılığının bir göstergesidir.

Numune içindeki bilinmeyen derişimi daha sonra aynı dalgaboyunda absorbansının ölçülmesiyle ve kalibrasyon grafiği yada Lambert-Beer yasası formülü yardımıyla bulunabilir.

Lambert-Beer Yasasından Sapmalar

Lambert-Beer yasasının çoğunlukla hiçbir istisnasının olmadığı düşünülür. Halbuki kurnaz ve zeki kimyagerler kolaylıkla bu yasanın bazı sınırlayıcı yanları olduğunu görürler ve ona göre önlem alabilirler. Bu yasanın başarısız ve yetersiz kaldığı, doğrusal kalibrasyon grafiklerinin elde edilememesinin üç temel nedeni vardır:

Yasanın kendisi sınırlayıcıdır; Güvenirliğin kaybolduğu bir konsantrasyon sınırı vardır ve bu limit analitten analite değişim gösterir fakat bu sınır kabaca 0.01 M olarak verilebilir. Bu sınırın nedeni ise yüksek derişimlerde veya elektrolit varlığında birbirlerine komşu moleküllerin elektrostatik etkileşimlerle enerji düzeyleri arasında bozulmalar meydana gelir. Hatırlarsanız bu enerji düzeyleri arasındaki elektronik geçişler molekülün absorpsiyon karakteristiklerini verir. Dolayısıyla bu bozulmalarla analiz dalgaboyunda molekülün absorpsiyonunda artış veya azalış olması beklenebilir. Her iki durumda da absorbans & Konsantrasyon arasında doğrusal olmayan bir bağıntı elde edilecektir. Özellikle doğrusallığın çok düşük derişimlerde bile elde edilemediği büyük organik iyonların analizinde çok dikkatli çalışılmalıdır. Örneğin Metilen mavisi için, derişim 0.000001 M dan daha az olmadıkça kalibrasyon grafiği doğrusal hale gelmez.

Kimyasal Sapmalar: Eğer analizi yapılan sistem kimyasal olarak değişimlere uğruyorsa analiz başarısız olacaktır. Bu sapma en çok pH değişikliği yapıldığı zaman rastlanmaktadır. Örneğin, dikromat gerçekte diğer iki krom türüyle denge halindedir ve bunların herbirinin kendine has molar soğurum değerleri vardır. pH değerinde oynama yapıldıkça bu üç krom türünün miktarlarında değişme olur ve ilgili dalgaboyundaki absorpsiyonda değişir. Bu türler arasındaki oran seyrelme ile dahi değişecektir.Bu ve diğer pH duyarlı sistemlerde ortamdaki türlerin mikterını dengede tutabilmek için sistem tamponlanmalıdır.

Enstrümental Sapmalar: Lambert-Beer yasası monokromatik ışıma (tek dalgaboyu) temeline dayanılarak türetildi. Pratik manada monokromatör tarafından seçilen dalgaboyu aralığı ne kadar küçük olursa cihaz o kadar pahalı olur. Bu problemi çözmek için monokromatörden geçen dalgaboylarının molar soğurumlarının birbirine çok benzer olduğu spektrum bölgesinde ölçümlerin yapılması gerekir. Bu maksimum absorpsiyondaki sebeptir. Diğer sebepler ise doğrudan ışık ve kirli, uygun olmayan numune hücreleridir.