DNA Replikasyonu
Bölüm 12
DNA
Kendi kopyasını yapabilir, Tamir edilebilir, Rekombinasyon geçirebilir.
Tanımlar
Replikasyon orijini: Replikasyonun başlangıç noktası
Replikasyon çatalı: Kromozom üzerinde replikasyonun olduğu noktada sarmala ait zincirlerin açılmasıyla ortaya çıkan bölgedir. Önce sentezin orijin noktasında meydana gelir ve replikasyon devam ettikçe ilerler.Replikasyon çift yönlü ise, orijinden itibaren zıt yöne doğru ilerleyen iki replikasyon çatalı oluşur.
Replikon: bir orijinden bir replikasyon başladıktan sonra replike olan DNA’nın uzunluğunun bir birim olduğunu belirtmek için kullanılan terimdir.
Replikasyon orijini (prokaryotik): E. coli’de replikasyon 245 bç uzunluğunda olan ve oriC olarak adlandırılan tek bir orijinden başlamaktadır. Bakteri ve bakteriyofajlarda replikasyon tek bir noktadan başladığından kromozomun tümü replikondur. Replikasyon oriC’den heri iki yöne doğru hareket eder. Replikasyon ilerledikçe ayrı yönlere doğru birbirlerinden uzaklaşan iki replikasyon çatalı oluşur. Çatallar tüm kromozom replike olduktan sonra ter olarak adlandırılan sonlanma bölgesinde birbiriyle birleşir.
Çoklu replikasyon orijini (Ökaryotlarda)
1.Ökaryotlarda birden çok replikasyon orijini (yeast 250-400, memelilerde 25,000’den fazla replikon) bulunur.
* Daha fazla DNA içerirler (maya e.coli’den 4 kat drosophiladan ise 100 kat fazla DNA içerir)
*Ökaryotik DNA pol’ın sn’de 50 nt olan sentez hızı bakteriyal polimerazlardan 20 kat daha yavaştır. ARSs (autonymously replicating sequences-özel replike olan diziler): 11 bç. Uzunluğundaki maya replikasyon orijinidir. Sentezin etkin başlamasını sağlayan kısa dizileri içerir. 20-80 replikon kümesi sıra ile aktive olur. Polimeraz çok büyük DNA dizilimi içinde ARS dizilerini, hücre döngüsünün S fazında başlayan bir mekanizma ile bulur. Hücre döngüsünün G1 fazında tüm ARS dizilerine bazı proteinler bağlanır (mayada 6 tane) ve orijin tanıma kompleksi(Origin Recognition Complex, ORC) oluşur.
Kinazlar sentez aşamasında fosforilasyonda görev alan enzimlerdir. ORC’ye bağlanırlar ve DNA pol bağlanması için ön replikasyon kompleksi (pre-RC) oluştururlar.Kinazlar aktive olduklarında DNA sentezini tetiklerler ve her replikonda DNA sentezi tamamlanana kadar tekrar pre_RC oluşumunu engelleyerek kopyalanan ve kopyalanmamış DNA’ları birbirinden ayırırlar.
DNA Polimeraz enzimleri Bakterilerde DNA sentezinde 3 polimeraz ve diğer enzimler görev alır 1957, Kornberg ve ark. E. coli’den in vitro olarak DNA sentezini yönlendiren bir enzim saflaştırmış ve DNA polimeraz I olarak isimlendirmiştir.
İn vitro DNA sentezi için enzimin ihtiyaçları; 1.4 tip nükleotid trifosfat (dATP, dCTP, dGTP, dTTP= dNTP)
2.DNA kalıbı
•4 dNTP’den herhangi biri eksik ise yada ortamda NTP’lar yerine nükleotitler ve nükleotid difosfatlar varsa sentez olmamaktadır.
•Kalıp DNA olmazsa sentez çok büyük oranda azalmaktadır. Kornberg’in izole ettiği enzim ile yapılan sentez şu şekildedir:
DNA Zincirinin Uzaması
DNA pol I’in biyolojik rolü halen şüpheli idi 1969 Delucia ve Cairns- DNA pol I aktivitesine sahip olmayan mutant bir E. coli suşu bulmuştur. Mutasyon polA1 olarak isimlendirilmiştir.
Ancak mutant suş onarım yeteneği bakımdan oldukça yetersizdir. Bu gözlemlerden sonra
Sonuç:
1. E. coli de in vivo replikasyon için en az bir pol daha olmalı
2. DNA pol I in vivo ikincil bir işlevi olmalıdır
DNA pol II ve III DNA pol ı aktivite içeren normal hücrelerden elde edilen özgün enzimlerdir.
DNA pol I, II ve III kalıptan DNA sentezi başlatamaz ve ancak primer adı verilen, var olan bir DNA zincirini kalıp boyunca uzatabilirler.
3’à5’ ekzonükleaz aktivitesi: enzimin polimerizasyonu tek yönde gerçekleştirme, bir an duraksayıp, geri dönerek ilave edilen nt’leri çıkarabilme özelliğidir. 5’->3’ ekzonükleaz aktivitesi :
DNA pol I’in özelliğidir. Enzim, sentezin başladığı uçtan itibaren nükleotitleri kesebilir ve sonra sentez yönünde işlemine devam edebilir. Bu nedenle DNApol I RNA primerini de uzaklaştırabilir. Ortamda pol III den daha fazla bulunur.
Pol Ià primeri uzaklaştırır ve oluşan boşlukları doldurur.
Pol II-> U.V hasarı nedeniyle oluşan mutasyonların tamirinde rol aldığı düşünülmektedir.
Pol III -> polimerizasyondan aslı sorumlu olan enzimdir. DNA polimeraz I’in Klenow fragmanı
DNA Polimeraz I’in 3′ à 5′ ekzonukleaz aktivitesi ile hataları düzeltmesi DNA Pol III’ün holoenzim olarak adlandırılan aktif formu, iki takım, 10 farklı polipeptit zincirinden meydana gelmiş bir dimerdir.
M. A 600.000 daltondur.
Core (çekirdek) enzim holoenzimin polimerizasyon aktivitesi gösteren kısmıdır. kompleks olarak adlandırılan ikinci bölgede 5 alt birim bulunur ve replikasyon çatalında enzimin kalıba oturtulmasında görev alır. b alt birimi, polimerizasyon sırasında enzimin kalıptan kopmamasını sağlar. P (pi), iki çekirdek polimerazın replikasyon çatalında bir arad tutunmasını sağlar.
REPLİZOM Holoezim ve diğer proteinlerin replikasyon çatalında oluşturdukları büyük kompleks.
DNA Replikasyonu Sırasında Birçok Karmaşık Olay Çözülmelidir
Priming discovery: Tuneko Okazaki: 1985
DNA Sentezi 5′ à 3′ Yönünde İlerler
Eğer zincir her zaman 5′ à 3′ yönünde ilerlerse her iki zincir nasıl aynı anda sentez edilebilir?
Bu soru 1960’larda Reiji Okazaki ve ark. tarafından çözüldü.
Okazaki fragmanları, bir DNA zincirinde sentez edilen kısa
DNA parçaları.
Leading strand (öncül zincir): 5′ à 3′ yönünde sürekli sentezin
yapıldığı zincir

…