1. GİRİŞ

Mikrobiyoloji laboratuvarlarında mikroorganizmaları tanımlamak için boyama yöntemlerine sıkça başvurulur. Boyama yöntemlerinde tek bir boya kullanıldığı gibi daha sıklıkla birden fazla boya birbiri ardına eklenerek kullanılır.

Boyama işlemleri genellikle bir lam üzerinde yapılır. Kullanılacak lam, daha önceden eter-alkol karışımı ile iyice temizlenmelidir. Boyama yapılacak örnek, bir lam üzerine ince tabaka halinde yayılır. Bu örnek çeşitli vücut sıvıları ve iltihabi akıntılar olabileceği gibi, kültürde üreyen bakteriler de olabilir. Boyanacak örneğin, lam üzerine yayılmasını takiben, preparatın, havada kuruması beklenir. Boyama yöntemine başlamadan önce, lam üzerinde hazırlanan preparatın tesbit edilmesi gerekir. Tesbit işleminin amacı, lam üzerindeki materyalin lama yapıştırılmasını ve bulaşıcı olan mikroorganizmaların ölmesini sağlamaktır. Laboratuvarda, bakteriyolojik preparatların tesbitinde en sık kullanılan yöntem, ısıdır. Isı ile bozulabilecek ökaryot hücrelerden zengin örnekler ile kan ve doku preparatlarının tesbitlerinde alkol, eter, aseton gibi maddelerden yararlanılır. Tesbit işlemi için preparatın alevden üç kez geçirilmesi, %95 alkolde veya eşit miktar alkol-aseton karışımında 10-20 dakika süre ile tutulması yeterlidir.

Lam üzerine yayılan örneğin tesbitinde neler kullanılır?

Tesbit işlemindeki amaç nedir?

2. MİKROBİYOLOJİDE KULLANILAN BOYALAR VE BOYAMA YÖNTEMLERİ

2.1. Mikroskobik Preparatların Hazırlanması

Mikroorganizmaların tanımlanması amacıyla hem boyamadan direkt mikroskopta hem de boyanarak incelenmeleri gerekir. Bu yöntemlerle mikroorganizmaların hareket, spor, kapsül, boyanma varlığı ve şekli gibi özellikleri araştırılır. Bu amaçla kültürlerden veya hastalık örneklerinden kurallara uygun preparatlar alınarak hazırlanır ve incelenir. İncelemeler çok yönlü olduğundan, hazırlanacak preparatların da inceleme bakımından çeşitli ayrıcalıkları olmaktadır.

2.2. Boyanma ve Boyalar

Boyama, mikrobiyolojik tanıda yardımcı bir yöntemdir. Boyanma, kimyasal bir olaydır. Boyalar genellikle tuz yapısındadırlar ve pH’larına göre asidik, bazik, nötral olabilirler. Mikrobiyolojide, daha çok bazik ve nötral boyalar kullanılır. Bazik boyalar, renkli katyon ve renksiz anyon içerirler. Bazik boyalara, metilen blue+ chloride– ve kristal viyole (Hexamethyl-p-rosanaline+ chloride–) örnek olarak verilebilir. Bu iki örnek boyanın renkli katyon kısımları, pozitif yüklü metilen mavisi ve rosanaline’dir. Bakteri hücresi, nükleik asitten zengin fosfat grupları nedeniyle negatif yüklüdür. Bu nedenle bakteri hücreleri bazik boyalar ile iyi boyanırlar. Asidik boyalar renksiz katyon içerirler ve bakterileri boyamazlar. Zemin boyamada ya da asit pH’lı ortamlarda kullanılırlar.

Nötral boyalara örnek, Giemsa ve Wright verilebilir. Bu boyalar, özellikle kan ve doku preparatlarının boyanmasında, kanın şekilli elemanları, hücreler ve bazı parazitlerin daha etraflıca gözlenmelerinde üstündür. Boyama işlemlerinde tek bir bazik boya kullanılmışsa, basit boyamadan söz edilir. Metilen mavisi, en çok kullanılan basit boyama yöntemidir. Birden fazla bazik boya kullanılarak, çeşitli mikroorganizmalar, farklı renkte boyanırlar. Birleşik boyama yöntemlerine örnek olarak Gram ve Aside-Alkole Rezistan Boyama (ARB veya AARB) verilebilir.

Bakteri hücresi boyayı nasıl alır?

Boyalar pH’larına göre kaça ayrılırlar?

Birleşik boyamanın özelliği nedir?

2.3. Gram Boyama Yöntemi

1884 yılında Danimarkalı Bakteriyolog Christian Gram tarafından tarif edilmiştir. Gram boyası ile mor renk alan bakteriler Gram pozitif (+) veya Gram olumlu, kırmızı renkte boyanan bakteriler ise, Gram negatif (–) ya da Gram olumsuz olarak adlandırılırlar.

Basillerin yaklaşık yarısı, kokların büyük kısmı ve mantarlar, Gram olumludurlar. Spiral şekilli bakteriler ise Gram negatiftirler.

Gram (+) pozitif veya Gram (–) negatif olsun kristal viyolet boyası ile tüm bakteriler mor renge boyanırlar. Ortama eklenen lugol solusyonu ile Gram (+) bakterilerin oluşturdukları yapı, daha sonra ortama eklenen alkol ile giderilemez. Oysa Gram (–) bakterilerin kristal viyole + lugol karışımları alkol ile giderilebilir. Bir başka deyişle, boya, bakteri hücresinden dışarıya salınır (dekolorizasyon). Gram (–) negatif bakterilerin, alkolle renkleri gittiğinden, ortama daha sonra eklenen sulu füksin ile boyanır. Böylece Gram (+) bakteriler mor renkte (kristal viyole rengi), Gram (–) bakteriler kırmızı – pembe renkte (sulu fuksin) boyanırlar. Gram boyanma özelliği bakteri duvar yapısı ile ilgilidir. Bakteriye Gram (+) boyanma özelliği veren Gram negatif ve Gram pozitif bakteri duvar ince yapıları Şekil 1 de gösterilmektedir.

Gram Boyama Yönteminde Aşağıdaki işlemler Sırasıyla Uygulanır:

Havada kurutulup alevde tesbit edilmiş preparat üzerine,
■ Kristal viyolet damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Preparat su ile yıkanır.
■ Lugol damlatılır, 1-2 dakika beklenir. Su ile yıkanır.
■ Alkol ile renksiz sıvı akana kadar renk giderilir. Su ile yıkanır.
■ Sulu füksin damlatılır, 30 saniye beklenir. Su ile yıkanır.

Kurutma kağıdı arasında hafifçe bastırılarak kurutulur. 100’lük büyütmeli objektif ile immersiyon yağı damlatılarak incelenir.

Gram olumlu ve olumsuz bakteriler hangi renkte görülür?

Gram olumsuz bakteriler neden mor renkte boyanmazlar?

Gram boyamada dekolorizasyon (renk giderme) hangi madde ile yapılır?

Tüberküloz basili ve benzer özellikteki bakteriler bazik boyalar ile diğer bakteriler gibi kolayca boyanmazlar. Bakteri duvar yapısının özelliği nedeniyle bazik boyalar ısıtılarak ve daha uzun süre bekletilerek hücre içine alınabilirler. Boyayı aldıktan sonra, ortama eklenen alkol ve asit karışımı ile renkleri giderilemez. Oysa diğer bakterilerin asit + alkol karışımında renkleri gider ve zemin boyamak için kullanılan boyanın rengini alırlar. Bu nedenle, bazı bakterilerin mikroskobik incelemelerinde asit ve alkole dirençli boyama yöntemlerine başvurulur. Ehrlich Ziehl-Neelsen metodu, ARB yöntemlerinden en sık kullanılanıdır. Tüberküloz, lepra basili, nokardialar ve diğer mikobakteriler ARB ile boyanırlar. Tüberküloz hastalığının tanımlanmasında, özellikle balgam başta olmak üzere çeşitli vücut ve sıvı örneklerinden, basil aranmasında değerli bir boyama yöntemidir.

ARB Yönteminde aşağıdaki işlemler sırası ile uygulanır :

Havada kurutulup alevde tesbit edilen preparat üzerine :
■ Karbol füksin damlatılır. Kaynatmamaya özen göstererek preparat alttan 2-5 dakika süre ile ısıtılır. Boya azaldığında tekrar damlatılarak eklenir. Kurumamasına özen gösterilir. Su ile yıkanır.
■ Asit alkol karışımı ile renk giderilir. Su ile yıkanır.
■ Metilen mavisi ile 1 dakika boyanır. Su ile yıkanır. Boyanan preparat üzerine bir damla immersiyon yağı damlatılarak x 100 büyütmeli objektif ile mikroskopta incelenir. Sonuçta asidoresiztan bakteriler, mavi zeminde kırmızı renkte görülürler.

Aside dirençli boyama için Kinyoun ve Fluorochome yöntemleri de kullanılır.

ARB yöntemi ile boyanan bakterilere örnekler veriniz.

Tüberküloz basili ARB yönteminde ne renkte boyanır?

2.4. Bakteriyolojide Kullanılan Diğer Boyama Yöntemleri

2.4.1. Metilen Mavisi İle Boyama

Bu amaçla en sık Löffler’in metilen mavisi kullanılır. Boyama işlemi için hazırlanan yayma havada kurutulur ve alevden geçirilerek tesbit edildikten sonra üzeri metilen mavisi ile örtülür. Yayma 30-60 saniye arasında boyayla temas ettirilir. Eğer daha uzun süre temas olursa, bakteriler ile diğer cisimlerin ayırt edilmesi güçleşir. Suyla yıkanıp, havada kurutulan yayma preparat immersiyon objektifi ile incelenir.

2.4.2. Kapsüllerin Boyanması

Kapsül ya boyanarak ya da zemin ve bakteri gövdesinin boyanması sonucunda boyasız bir bölge olarak gösterilebilir. Kapsülü, boyanmayan boşluk görünümünde incelemek için, en sık kullanılan boya çin mürekkebidir. Bu mürekkepten temiz bir lam üzerine bir damla konur. İncelenecek örnek veya kültürden aynı miktarda alınarak karıştırılır. İnce yayma yapar gibi bir lam yardımı ile yayılır. Yaymada kapsüller, siyah zemin üzerinde renksiz olarak görülürler. Kapsülün boyanarak incelenmesinde Muir veya benzeri yöntemler kullanılır. Bu boyama sonucunda kapsüller mavi, hücreler kırmızı renkte görülürler.

2.4.3. Sporların Boyanması

Modifiye Wirtz yöntemi kullanılabilir. Bu yöntemle sporlar yeşil, hücreler kırmızı görülür. Sporlar Gram boyasını almazlar. Sporlar, bakterilerin içerisinde boyanmayan boşluklar şeklinde görülürler. Sporları boyayarak gösterebilmek için Modifiye Wirtz yöntemi kullanılabilir.

Ayrıca bakterilerin hücre içi vakuollerini, kirpiklerini, metakromatik cisimciklerini boyamada kullanılan özel yöntemler vardır. Sayılan yöntemler ve diğer birçok boyama işlemlerinin amacı direkt mikroskobik incelemelerde mikroorganizmalara ait özel yapıların gösterilebilmesidir. Bu çalışmalar, tanımsal ve aynı zamanda araştırma amaçlıdır.

2.4.4. Mantar Boyaları

Maya ve maya benzeri mantarlar, bakteri boyalarıyla (özellikle Gram yöntemi) kolayca boyanabilirler. Küf biçiminde üreyen mantarların tanımlanmasında ise bazı özel boyalar kullanılır. Bu boya ve maddeler şunlardır:

■ Laktofenol pamuk mavisi : Laktik asit, fenol, gliserin ve pamuk mavisinin distile sudaki karışımıdır. Hif yapılarının ve sporların daha iyi görülmesini sağlar.

■ KOH : %4-10-30’luk sulandırımları kullanılır. Dokudan hazırlanan direkt preparatlarda kitin ve mukus dokusunun parçalanmasını sağladığından mantar elemanlarının daha kolay bir biçimde açığa çıkmasını sağlar. Özellikle deri, saç ve tırnağın mantar infeksiyonlarının tanımlanmasında kullanılır.

Kapsül ve sporların varlığının gösterilmesinin önemi nedir?
Deri kazıntıları, saç ve tırnak örneklerinin potasyum hidroksit ile karıştırılmasındaki amaç nedir?

2.4.5. Virus Boyaları

Viruslar ancak elektron mikroskobu ile görülebilecek boyutlardadır. Elektron mikroskobik incelemeler için preparat hazırlanması özel teknikleri ve bu konuda deneyimli personeli gerektirir. Virusların üremeleri sonucunda hücre içerisinde oluşturdukları inklüzyon cisimcikleri ışık mikroskobunda özel boyalarla boyandığında gözlenebilir. Bu amaçla en çok kullanılan boyalar Giemsa ve Wright’dir. Kuduz virusunun beyinde oluşturduğu ve Negri cisimciği olarak anılan yapılar, Seller metodu ile boyanır. Bu boyama ile Negri cisimcikleri parlak vişne renginde, çekirdek maddeleri koyu mavi, sinir hücreleri mavimsi renktedir. Viruslar ayrıca hücre kültürlerinde üretilerek, gerek hücrelerde oluşturdukları değişiklikler gerekse oluşturdukları inklüzyon cisimleri çeşitli boyalar kullanılarak incelenebilir.

Işık mikroskobunda viruslara ait gözlenen oluşumların adı nedir?

Negri cisimciği nedir?

Ayrıca daha özel amaçlarla kullanılan boyalar da vardır. Bunlar;
PAS (Periyodik Asit Schiff)
Gomori metanamin silver boyası
Hematoksilen-eozin boyası
Papanicalou direkt yayma boyası
Sözü edilen bu boyama yöntemleri patoloji dersleriniz içerisinde geçecektir.

2.4.6. Parazit Boyaları

Dışkının parazitolojik açıdan mikroskobik olarak incelenmesi boyalı ve boyasız olarak yapılır. Boyasız preparatların hazırlanmasında serum fizyolojik kullanılır. Ayrıca biyokimyasal incelemeler için çeşitli boya ya da kimyasal maddelerden yararlanılır.

Serum fizyolojik ile inceleme: Lam üzerine bir damla serum fizyolojik konur. Temiz bir tahta çöp yardımı ile bir parça dışkı alınarak serum fizyolojik ile karıştırılıp, süspansiyon haline gelmesi sağlanır. Daha sonra üzerine lamel ile kapatılarak ışık mikroskobunun önce 10’luk, daha sonra 40’lık objektifleriyle incelenir. Bu yöntemde boya kullanılmadığından protozoonların insanlarda hastalık yapan hareketli trofozoit şekillerini görmek mümkün olur.

Boyalı inceleme: Bu amaçla kullanılan başlıca boyalar eozin ve lugol’dür. Bu metodlar ile dışkıda parazit yumurtaları, kistleri ve larvalarının ince yapılarının görülmesi mümkündür.
Eozin boyası: Eozinin serum fizyolojik içindeki %0,1’lik sulandırımından bir kaç damla taze dışkı üzerine eklenir. Lamel ile kapatılır. Zemin kırmızı, parazit yumurtaları ise soluk pembe boyanır.
Lugol: Potasyum iyodür ile iyot karışımı olan lugol solusyonu taze dışkı preparatı üzerine 1 damla damlatılır ve lamel ile kapatılır. Parazit yumurtaları sarı-kahverengi olarak boyanırlar.

Dışkının parazitolojik incelenmesinde santrifüj ve diğer yöntemlerle yoğunlaştırma işlemi yapılarak parazit elemanlarının görülme oranı arttırılabilir.

…

Kaynak: https://munzur.edu.tr/birimler/akademik/yuksekokul/syo/bolumler/fizik/Pages/file/Mikro06.pdf