Mikrobiyal Gelişim ( Dr. Halil TOSUN )

7. BÖLÜM • MİKROBİYAL GELİŞİM

Gelişim • Tek hücreli organizmalarda sayı artışı – Bakterilerde en çok görülen üreme şekli ikiye bölünmedir (mikroorganizma sayısı) • Çok hücreli organizmalarda kütle artışı – Genelde funguslarda görülen kütlesel artıştır (mg)

• Hücre sayısı, ikiye bölünerek üreyen mikroorganizmalarda 1-2-4-8-16-32-64-128…… şeklinde iki katına çıkarak artar.

Jenerasyon süresi • Bir bakterinin ikiye bölününceye kadar geçirdiği süredir. • Jenerasyon süresi – Ortamdaki besin elementlerine – Besin elementlerinin miktarına – Fiziksel koşullara – Üremenin hangi fazda olduğu – Mikroorganizmanın türüne göre değişir.

Örneğin; (optimum koşullar altında) Mikroorganizma Jenerasyon süresi (saat) Escherichia coli 0.33 (bakteri) Mycobacterium 18 tuberculosis (bakteri) Staphylococcus 0.5 aureus (bakteri) Saccharomyces 2 cerevisiae (maya) Neurospora crassa 12 cm/gün (koloni (küf) çapında artış)

Bakterilerde üreme eğrisi • Bir bakteri kültürü uygun bir besiyerine ekilip, • İnkübasyon süresince belirli aralıklarla besiyerinden örnekler alınıp, • Standart plak sayım yöntemlerine göre ekimler yapılıp, • Sonuçlar grafik üzerine geçirildiğinde, • STANDART ÜREME EĞRİSİ elde edilir.

population growth ceases duraklama fazı Bölünmenin, dolayısıyla Ölüm fazı üremenin en hızlı olduğu dönem Üreme yok Şekil. Bakterilerde üreme eğrisi

Lag fazı (Gecikme dönemi) • İlk bölünmenin başladığı zamana kadar geçen süredir. • Hücre sayısında artış olmaz. • Üreme için gerekli yeni bileşenler, enzimler sentezlenir. • Hücreler yeni besi ortamına veya diğer koşullara adapte olurlar.

Eksponensiyel faz (logaritmik üreme fazı) • Logaritmik üreme dönemi olarak da isimlendirilir. • Üremenin en hızlı (jenerasyon süresinin en kısa) olduğu dönemdir. • Kimyasal ve fiziksel etmenlere en fazla duyarlı olunan dönemdir (bu dönemdeki mikroorganizmaları öldürmek daha kolaydır).

• Logaritmik üreme döneminin sonlarına doğru ortamdaki besin maddeleri azalmaya • Bakterilerin oluşturduğu metabolik ürünler birikmeye başlar. • Böylece bir çok hücrenin üremesi durur, hatta bazıları ölür (Ölüm fazı).

Duraklama fazına geçişin muhtemel nedenleri: • Besin maddelerinin sınırlanması • Oksijen kullanılabilirliğinin sınırlanması • Toksik atıkların birikimi • Populasyon yoğunluğunun artışı

Duraklama fazı • Çoğalan hücre sayısı ile ölen hücre sayısı birbirine eşit sayıdadır. – Metabolik olarak aktif olan hücrelerin çoğalmalarının durmasına bağlıdır. – Çoğalma hızı ölüm hızıyla denge halindedir.

Ölüm fazı • Hücreler logaritmik düzeyde (hızlı) ölmeye başlarlar. • Ölüm – Üreme yeteneğinde geri dönüşümsüz kayıplar olur. • Ortamda dirençli hücreler varsa ölüm oranı daha yavaş seyredebilir. • Bazı bakteri suşları tamamen ölürken, sporlu olanlar canlılığını koruyabilir.

population growth ceases duraklama fazı Bölünmenin, dolayısıyla Ölüm fazı üremenin en hızlı olduğu dönem Üreme yok Şekil 1. Bakterilerde üreme eğrisi

Gelişimin matematiksel hesaplanması • B-Başlangıçtaki mikroorganizma sayısı • b-İnkübasyon süresi sonundaki mikroorganizma sayısı • n-İnkübasyon süresindeki jenerasyon sayısı logb=logB x n x log2 n=logb/logB x 1/log2 n=3.3 logb/B

• G-Jenerasyon süresi • t-Toplam inkübasyon süresi • n-Jenerasyon sayısı G=t / n G=t / 3.3 log b/B

Mikrobiyal gelişimin ölçülmesi • Mikrobiyal populasyondaki hücre sayısındaki değişiklikler saptanabilir. • Mikrobiyal populasyondaki kütle artışındaki değişiklikler saptanabilir.

Hücre sayısının saptanması • Direk hücre sayım yöntemleri – Direk sayım yöntemleri – Elektronik sayım yöntemleri – Membran filtre üzerinde sayım • Canlı hücre sayım yöntemleri – Plak sayım yöntemleri – Membran filtrasyon

Direk sayım yöntemleri • Uygulaması kolaydır, ucuzdur ve pratiktir. • Ökaryot ve prokaryot hücrelerin her ikisinin sayımı için uygundur. • Canlı ve ölü hücrelerin her ikisi de sayılır. Şekil 3

Elektronik sayım… • Ölü ve canlı hücreler ayırt edilemezler. • Kullanımı kolay ve pratiktir. • Büyük hücreler ve kan hücreleri için uygundur. Prokaryotlar için uygun değildir.

Membran filtre üzerinde sayım • Hücreler koyu bir zemin üzerinde görünecek şekilde özel bir filtreden süzülür. • Hücreler floresan bir boya ile boyanırlar. • Bakteri sayımında kullanılır. • Ancak belirli bazı boyalar ile canlı hücrelerle ölü hücreler ayırt edilebilir.

Plak sayım yöntemleri Uygun bir katı besiyeri yüzeyine hazırlanan • Canlı hücre dilüsyonlardan ekim sayısı saptanır ↓ • Sayım “koloni Oluşan kolonilerin sayımı oluşturan birim” ↓ olarak ifade Gramdaki sayının edilir (“colony hesaplanması forming units”) • KOB, CFU

Plak sayım… • Basit ve hassastır • Gıda, su ve toprak gibi örneklerdeki. mikroorganizma sayısının saptanmasında kullanılır. • Zincir veya grup halindeki organizmaların tek koloni oluşturması yöntemin dezavantajıdır.

Membran filtrasyon yöntemi Şekil 4. Özellikle sıvı örneklerin analizi için uygundur.

Gelişimin hücre (misel) ağırlığının ölçülmesiyle saptanması • Kuru ağırlığın saptanması – Uzun süre alır ve çok hassas değildir • Bazı özel hücre bileşenlerinin saptanması – Örneğin; protein, DNA, ATP, veya klorofil – Söz konusu bileşenlerin her bir hücredeki miktarı sabit ise kullanımı uygundur • Turbidimetrik ölçümler (ışığın dağılımı ile saptanır) – Hızlıdır, uygulaması kolaydır ve duyarlıdır.

Daha fazla mikroorganizma ↓ Işığın daha fazla dağılımı ↓ Işığın daha az saptanması Şekil 5

Mikroorganizmaların gelişimi üzerine çevresel faktörlerin etkisi • Mikroorganizmaların büyük bir kısmı ortalama çevresel koşullar altında gelişebilir. • Bir kısmı ise, büyük bir kısmının öldüğü zor koşullar altında da üreyebilmektedirler (ekstremofiller).

Su aktivitesi (a ) w • Mikroorganizmalar tarafından kullanılabilen suyun miktarıdır. – Suda çözünen madde miktarıyla direk ilgilidir. – Çözünen madde miktarı arttıkça aw azalır. • 0-1 arasında bir değerdir.

Ozmotolerant organizmalar • Stabiliteleri ve aktiviteleri için yüksek oranda çözünen madde konsantrasyonuna ihtiyaç gösteren protein ve membranlara sahiptirler (ozmofilik maya) (zerofilik küf). • Geniş bir aw aralığında gelişebilirler. • Halofiller – Gelişimleri için yüksek oranda NaCl’e ihtiyaç gösterirler

pH Hidrojen iyon konsantrasyonunun negatif logaritmasıdır. Şekil 6

pH • asidofiller – optimum pH 0 -pH 5.5 aralığında gelişirler • nötrofiller – optimum pH 5.5 – pH 7 aralığında gelişirler • alkalofiller – optimum pH8.5 – pH 11.5 aralığında gelişirler

Sıcaklık • Mikroorganizma- lar farklı gelişim sıcaklıklarına ihtiyaç gösterir- ler. – minimum Şekil 7 – maksimum – optimum

• Mezofiller; optimum oda sıcaklığında gelişebilen mikroorganizmalardır. Vücut sıcaklığında gelişebilenler bu gruptadır. – İnsanlarda hastalık yapan mikroorganizmaların çoğunluğu mezofildir. • Psikrofiller; optimum 20ºC civarında gelişebilen mikroorganizmalardır. – Buz dolabında saklanan gıdalarda bozulmalara neden olurlar.

• Termofiller; yüksek sıcaklığa dayanıklı mikroorganizmalardır. – Yüksek ısısal işlem gören gıdalarda canlı kaldıkları takdirde, şartlar uygun olduğunda gelişerek bozulmalara neden olabilirler.

Oksijen konsantrasyonu Oksijen Oksijen Oksijen Oksijen < 2 – 10% İhtiyacı tercih önemli istenmez Oksijen var edilir değil istenir Şekil 9

• Aerob : Gelişimleri için oksijene ihtiyaç duyan mikroorganizmalardır. • Fakültatif anaerob: Oksijenli ortamı tercih eden, ancak oksijensiz ortamlarda da gelişebilen mikroorganizmalardır. • Anaerob : Oksijensiz ortamda gelişebilen mikroorganizmalardır. • Mikroaerofil: Gelişimi için çok az oksijene ihtiyaç duyan mikroorganizmalardır.

Radyasyon Şekil 10

• İyonize radyasyon – x ışınları ve gamma ışınları – mutasyon →ölüm – DNA gibi bazı moleküllerin kimyasal yapısında hasar • ultraviyole (UV) radyasyon – mutasyon →ölüm