Biyoteknolojide Enzimler

BİYOTEKNOLOJİDE ENZİMLER

Enzimler
canlı organizmalarda substratların kimyasal değişimini katalizleyen kompleks moleküllerdir. Enzimler in vitro koşullarda da katalitik aktivite gösterdiklerinden, mikroorganizmaların bu proteinleri bol miktarda üretmeleri sonucu izole edilerek çeşitli endüstriyel alanlarda kullanılabilirler.

Günümüzde enzimler: süt ürünlerinin üretiminde, biracılıkta, etlerin işlenmesinde, meyve sularının berraklaştırılmasında, früktoz şurubu üretiminde kullanılmalarıyla gıda sektöründe, protein ve yağ artıklarını parçalamak üzere deterjan endüstrisinde, deri ve dokuma ipliklerinin işlenmesini kolaylaştırarak tekstilde, teşhis ve tedavi amacıyla tıpta kullanılmaktadırlar (Tablo 6.1).

Tablo 6.1. Bazı enzimleri kullanım alanları ve elde edildikleri mikroorganizmalar.

ENZİM                                   KULLANIM ALANI                                          MİKROORGANİZMA

α-amilaz                     Maltoz
ve dekstrinin yıkılması
Bacillus subtilis

                                   Leke
çıkarıcı                                                               Aspergillus
oryzae

                                   Unun
zenginleştirilmesi
B. licheniformis

                                   Glikoz
şurubu

β-glucanaz                 β-glukanın
parçalanması yoluyla                               A. oryzae

                                   biranın
berraklaştırılması.
B.subtilis

 

Katalaz                       İçeceklerin
bozulmasını önlemek için                       A. Niger

 

Selülaz
Deterjan katkı
maddesi                                              Penicillum spp.

                                   Atıkların
değerlendirilmesi

                       

Glikoz izomeraz         Glikoz, Fruktoz           dönüşümü                              Aspergillus
spp.

                                                                                                                      Streptomycetes
spp.
                                                                                                                                   

Glikoz oksidaz            Biyosensor                                                                A.niger

 

Laktaz                         Laktoz
Glukoz+Galaktoz                                      Kluyveromyces laktis

                                   (Peynir altı
suyu)

                                   laktozsus
gıda üretimi

 

Lipaz                           Deterjan
katkı maddesi
Yağların parçalanması                                  

                                   Peynir
Endüstrisi                                                     A. oryzae

                       

Pektinaz                     Meyve suyu ekstraksiyonu                                     Erwinia spp

                                   Şarap ve
meyve suyu

                                   berraklaştırılması                                                                                                                              .

 

Proteaz                       Deterjan katkı maddesi                                             B.
Subtilis

                                   Deri
Endüstrisi, et ekstraksiyonu

                                   Sindirime
yardımcı

Renin                          Peynir Endüstrisi                                                       Kluyveromyces lactis                                                                                                                                  Mucor spp.

Sukraz (invertaz)        Şekerleme Endüstrisi                                                Saccharomyces spp.

 

Enzimlerin bu şekilde endüstriyel süreçlerde kullanılmaları işlemlerine “enzim teknolojisi” denir. Enzim teknolojisi, mikrobiyal işlemler (üretici suşların seçimi, geliştirilmesi vb.), enzimlerin fermentasyon yoluyla üretimleri (büyük ölçekte üretimi için yapılan besiyeri, ortam koşulları vb. düzeylerdeki optimizasyonlar), katalitik etkinliğin arttırılması için enzimlerin üç boyutlu yapılarının değiştirilmesi (protein mühendisliği), izolasyonları ve immobilizasyonları (enzimlerin çözünmeyen destek materyaller yardımıyla suda çözünmeyen hale getirilmesi) çalışmalarını kapsar.

Enzimler bitkisel, hayvansal veya mikrobiyal kaynaklardan üretilmektedir. Bazı özel uygulamalar için bitkisel ve hayvansal kaynaklı enzimler özel önemlerini korumakla birlikte son 30 yıldan beri teknik uygulamalar için mikrobiyal kaynaklar ağırlık kazanmaya başlamıştır. Enzimlerin mikrobiyolojik yolla üretilmesinde genellikle derin kültür tekniği ve aerobik karıştırmalı tank tipi biyoreaktörler kullanılır.

Mikroorganizmalar yardımı ile enzim üretimi birçok faktör tarafından etkilenir. Besi ortamının kompleks kimyasal bileşimi, indüksiyon ve represyon gibi iç faktörler yanında pH ve oksijen temini gibi dış faktörler de enzim verimi için önemlidir. Mikroorganizma seçimi bir başka önemli konudur. Seçilen mikroorganizma kısa sürede yüksek verimle enzim üretebilmeli, toksik madde ve antibiyotik üretmemeli, ucuz besi ortamında rahatlıkla çoğalabilmeli, gerek enzim üretimi sırasında gerekse izolasyon ve saflaştırma işlemleri sırasında problem oluşturacak yan ürünler üretmemelidir.

Enzimlerin üretiminde yararlanılan besin ortamları genellikle kompleks karbon ve azot maddelerinin karışımıdır. Besin ortamı karbon ve enerji kaynağı içermek zorundadır. Çoğu kez ortama mineraller ve bazı
büyüme faktörleri de eklenir. Eğer indüklenen bir enzim üretilecekse ortamda indüktör bulunmalı fakat repressör bulunmamalıdır. Substratlar genellikle indüktör etkiye sahiptir. Örneğin amilaz için nişasta, üreaz için üre indüktör etkiye sahiptir. Bazı substratlar düşük konsantrasyonda indüktör, yüksek konsantrasyonda repressor olarak etki gösterebilir. Substratların çok yavaş parçalanabilen türevleri güçlü bir indüktif etkiye sahiptir(invertaz için sakkarozpalmitat). Koenzimlerde indüktör olarak etki gösterebilirler. Örneğin tiamin, piruvat-karboksilaz verimini artırmaktadır. Bazı durumlarda üretilecek enzimin katalizlediği reaksiyonun
ürünü enzim için indüktör etkiye sahip olabilmektedir (Beta- amilaz üretiminde maltodekstrin ve pullanaz üretiminde maltoz). Bazı enzimler için ise tamamen ters bir etki söz konusu olup ürünler repressör etki gösterirler. Katabolik represyon olarak adlandırılan bu etkiyi ortadan kaldırmak için şu önlemler alınabilir.

1. Glikoz gibi kolay değerlendirilen substratlarca zengin besi ortamlarından kaçınmalıdır.

2. Represif etkili maddenin besi ortamındaki konsantrasyonunu düşürmek gerekir.

3. Büyüme faktörlerinin konsantrasyonu ve sıcaklık düşürülerek veya zayıf toksik etkili maddelerin ilavesi ile büyüme hızının düşürülmesi.

Katabolik represyon durumunda  karbon kaynağı seçimi çok kritiktir. Glikoz gibi kolay değerlendirilebilen madde durumunda, fermentör ortamındaki glikoz konsantrasyonu düşük tutulmalıdır. Bu ise azar azar ama sürekli glikoz ilavesiyle sağlanır. Enzim veriminde azot kaynağının (amonyak nitrat veya organik azot bileşikleri) doğru seçilmesi ve mineral ve iz elementler arasındaki oran da önemlidir. Besi ortamının optimizasyonunda ortam bileşenleri, üretimden sonra enzimin saflaştırılmasını en az etkilemeli ve fermentasyon sonunda büyük ölçüde tüketilmelidir. Enzim üretiminde kullanılan besi ortamlarına karbon kaynağı olarak, tahıl küspesi, soya küspesi, buğday ve pirinç kepeği, melas ve patates nişastası örnek olarak verilebilir. Azot kaynağı olarak ise balık unu, jelatin, kazein, kepek, peptonlar ve soya küspesi örnek olarak verilebilir. Büyüme maddeleri ve iz element içeriği olarak ise maya ekstraktı, bitkisel yağlar, yağlı tohum küspesi ve kepek kullanılabilir.

Araştırma laboratuarlarında kullanılan besin ortamları çok iyi formüle edildiği için tipik bir kesikli kültürde mikroorganizmanın üremesi, besin sınırlaması, enzim üretimi gibi parametreler çok net gözlemlenir. Ancak büyük ölçekli üretimlerde durum böyle değildir. Çünkü ticari uygulamalarda daha ucuz ve kolay elde edilebilir substratlar kullanılır. Bu substratların içeriği komplekstir. Bu yüzden mikroorganizma üremesi,  enzim kapasitesi ve besin elementlerinin etkisini net görmek zordur.

Enzim üretiminde yeni bir mikroorganizma ile çalışılacaksa ilk çalışma katı besiyerinde küçük ölçekli daldırmalı kültür üzerinde (çalkalamalı erlen denemeleri) yapılmalıdır. Daha sonraki aşamada küçük ölçekli enstrümantal donanıma sahip parametrelerin ölçülebildiği bir karıştırmalı biyoreaktörde devam edilmelidir. Her aşamada oksijen çok iyi ayarlanmalı ve öncelikle enzimin stabilitesi düşünülmelidir. Tablo 6.2’de büyük ölçekli enzim üretiminde kullanılan besin ortamları ve çevresel faktörler verilmiştir.

Tablo 6.2. Enzim üretiminde gerekli besin ve çevresel faktörler.

Azot Kaynağı    

Soya unu

Balık yemi

Maya hidrolizatları

Ve ekstrakları

Kazein

Amonyak

Amonyum tuzları

 

Karbon Kaynağı

Mısır, mısır unu, buğday unu, mısır
nişastası, arpa, gam arabik, hidrolize mısır nişastası, laktoz, glikoz,
pancar pulpu

Element ve Vitaminler

Karbonat, sülfat ve sitratların
kalsiyum, demir ve sodyum tuzları

Güç ihtiyacı

Bakteri ve funguslar için: 1-3 kW m-3

Miselli bakteri ve küfler için:4-6
kW m-3

Havalandırma

0,1-1,0 m3 m-3
min

Enzim Üretiminin Temel Basamakları

Kültürün Çoğaltılması: Tipik bir enzim üretiminde kullanılacak olan mikroorganizma önce laboratuar koşullarından başlayarak aşama aşama kesikli kültür yöntemiyle çoğaltılır. Araştırma laboratuarlarından elde edilen kültürler genellikle liyofilize formda ampüller içinde firmaya gelir. Bu kültürlerden başlayarak aşama aşama ve her aşamada %1- 5 mikroorganizma kültürü aşılanmış besiyerinde kültür çoğaltılır. Laboratuar koşullarında erlen lerde yapılan çoğaltma işlemlerinde genellikle mikroorganizmanın hızlı üremesini teşvik etmek için zengin besin içerikli ortamlar hazırlanır. Daha sonra ki ara biyoreaktörlerde ise üretimin yapılacağı besin ortamına yakın içeriğe sahip ortamlar hazırlanır. Laboratuar ölçeğinde yapılan çalışmalarda 10-40lt, pilot ölçekli denemelerde 100-200lt hacimli reaktörlerde çalışılır. Bu koşullarda reaktör koşullarını etkin bir şekilde takip etmek
mümkündür. Bu aşamada gözlemlenmesi gereken parametreler şunlardır:

-Çözünmüş oksijen miktarı

-Soğutma suyu

-Oksijen, karbondioksit ve diğer gazların konsantrasyonları

-Köpük kontrolü

-Sistem Sıcaklığı

Pilot ölçekli çalışmalardan sonra endüstriyel boyutta üretime geçilir. Bu aşamada kullanılan biyoreaktörlerin hacmi genellikle 25-100m3 olup hacim sınırlayıcı temel unsur oksijen transferidir.

Enzimlerin İzolasyon ve Saflaştırılmaları: Üretilen enzimin hücre içi veya hücre dışı olması izolasyon yönteminin seçimini belirler Şekil 6.1. Hücre içi enzimlerin izolasyonu için önce hücrenin parçalanması gerekmektedir. Bunun için aşağıda belirtilen yöntemler kullanılabilir.

Hücrelerin Parçalanması

Alkali ile Muamele: Mikroorganizma hücreleri pH 11-12 olan alkali ortamda 20-30 dakika inkübe edildiğinde hücre membranı parçalanmakta ve membrana bağlı komponenetler de serbest hale geçmektedir. Bu yöntem daha çok terapötik enzimler için uygundur.

Lizozim ve EDTA ile Muamele: Lizozim hücre membranında bulunan beta 1-4 glikozit bağını parçalar. Ortama EDTA katıldığında gram negatif bakterilerin membranı da parçalanır. EDTA zarın stabilitesi için esas olan iki değerlikli katyonlar ile şelat oluşturur ve lizozim etkisine olanak sağlar.

Deterjanlar ile Muamele: Deterjanlar membranlardaki lipoproteinleri çözer ve membran geçirgen hale geçer

Soğuk Şok: Mikroorganizma hücrelerinin normal büyüme sıcaklığından ani olarak 0°C’ye soğutulmalarına soğuk şoku denir. Büyük ölçekli üretimler için uygun bir yöntem değildir.

Osmotik Şok: yöntem, mikroorganizmaların besi ortamı komponentlerinden tamamen kurutuluncaya kadar uygun bir tamponla yıkanması ve ardından %20 sakkaroz çözeltisinde yeniden dağıtılması esasına dayanır. Osmotik şok gram pozitif bakterilerin rettiği enzimler için uygun değildir.

Ultrases: Ultrases (20kHz den daha yüksek frekanslı sesler) 1950 den beri hücrelerin parçalanmasında kullanılan bir tekniktir.

Dondurma ve Çözündürme: Genelde bu uygulama yalnız başına iyi bir sonuç vermez. Dondurma ve çözme enzimde yapısal değişikliklere neden olduğu için verim düşüşüne neden olur.

Katı Kırma: Hücre parçalanmasında endüstriyel boyutta ilk kullanılan tekniktir. Maya pastası ve kieselgur karıştırılıp karışıma hidrolik basınç uygulanmıştır.

Sıvı Kırma: Bugün için endüstriyel boyutta en verimli tekniktir ve iki şekilde uygulanır. Yüksek basınç homojenizatörü ve Küreli değirmenler. Yüksek basınç homojenizatöründe mikroorganizma hücrelerinin parçalanması için süspansiyon 560 kg/cm2 değerine kadar çıkabilen basınç altında bir iğneden geçmeye zorlanır. İğneyi terk eden süspansiyon atmosfer basıncı ile karşılaşır. Bu basınç farkı hücrelerin parçalanmasına neden olur. Küreli Değirmenlerde ise kürecik çapı 0,3-1,0mm arasında değişen cam veya aluminyum oksitten yapılmış değirmenlerde hücreler öğütülür. Bu mekanik işlem sırasında açığa çıkan enerji
kararlılığı düşük enzimler için problem yaratır. Süspansiyonun etkin bir şekilde soğutulması gerekir.

Ayırma Yöntemleri

Çöktürme: Çöktürme işleminde genellikle nötral tuzlar, organik çözgenler ve suda çözünen bazı polimerler kullanılır. Enzim saflaştırmada çöktürme işlemi iki amaçla kullanılır. Birincisi ayrılacak enzim çözeltide tutulup safsızlıklar çöktürülür. İkincisi enzim çöktürülüp safsızlıklar çözeltide tutulur.

Santrifüjleme: Boru tipi santrifüjler kısmen kesiksiz sistemlerdir ve silindir katı madde ile doluncaya kadar çalışırlar. 10 litre kadar katı madde toplandıktan sonra santrifüj boşaltılır. Bu yöntemle iyi sedimente olmayan protein çökeleklerini ayırabilirler.

Filtrasyon: Enzim izolasyonunda filtrasyondan iki amaçla yararlanılır. Çökeleklerin ve proses çözeltisinden çözünmeyen kısmın ayrılması. Biyolojik materyallerin filtrasyonunda prensip olarak sabit basınç uygulanır. Filtrasyonu kolaylaştırmak için kesiksiz proseslerde kieselgur veya odun talaşı kaplanmış vakumlu döner filtrler kullanılır.

Ekstraksiyon: Katı- sıvı ayırmasında partikül çapından kaynaklanan teknolojik problem ekstraksiyon yöntemi ile aşılabilir. Sulu çok fazlı sistemler oluşturulur ve hücre ile ayrılması amaçlanan enzimler farklı fazlarda bulunur. Fazların ayrılması seperatör veya çökelme tanklarında gerçekleştirilir.

Saflaştırma

Kromatografik Teknikler: Bu yöntemde enzimlerin elektriksel yük, lipofilik özellikleri, difüzyon hızı, aktif merkez özellikleri vb karakterlerinden yararlanılır. Kullanılan teknikler şunlardır.

İyon Değişim Kromatografisi: Bilindiği gibi yapı olarak protein olan enzimler amfoter karakterlidir, ortamın tuz konsantrasyonuna ve pH ya bağımlı olarak polianyonik veya polikatyonik yapıdadırlar. Dolayısıyla iyon değiştirici reçineler tarafından tutulabilirler. Enzimlerin çoğunun izoelektrik noktaları asidik bölgede yer aldığından anyon değiştirici reçineler ile kromatografi daha uygun olmaktadır. Reçinelere örnek olarak selüloz bazlı iyon değiştirixi reçineler, dekstran ve poliakrilamid jeller örnek olarak verilebilir.

Jel Filtrasyonu: Jel filtrasyonunda ayırmada etkili olan parametreler molekül şekli ve büyüklüğüdür. Sabit fazı oluşturan materyal gözenek boyutu belli  olan çapraz bağlı hidrofil polimerlerdir. Gözeneklerden jel derinliklerine girebilen moleküller güçlü bir şekilde tutulabilirler. Jel filtrasyonunda kullanılan filtrasyon materyali poliakrilamid, agaroz, dekstran ve bunların kombinasyonu ile oluşturulan çapraz bağlı türevlerdir.

Affinite Kromatografisi: Affinite kromatografisinde enzim aktif merkezinin adsorbanta bağlanmasıesasına dayanır. Adsorban olarak  kullanılan jel ve polimerlere enzimin substratının bir analoğu, kompetetif inhibitörü veya enzim ile tersinir etkileşebilen bir ligand kovalent bağlanmıştır. Affinite reçinesi olarak adlandırılan böyle bir adsorban bir kolona doldurulur ve ham enzim ekstraktı kolondan uygun bir tampon ile geçirilirse ayrılacak enzim kolonda tutulur. Safsızlık oluşturan diğer maddeler kolonu terk ederler. Daha sonra kolon koşulları değiştirilerek tutulmuş olan enzimin elusyonu gerçekleştirilebilir. Ham ekstraktın hedeflenen enzimin tek adımda oldukça saf olarak elde edilmesine olanak veren bu teknik laboratuar uygulamalarında çok başarılı bir şekilde uygulanmakla birlikte endüstriyel uygulamaları çok sınırlıdır. (Her enzim için ayrı bir reçine hazırlanması gerekebilir).

Elektroforetik Teknikler: Belirli bir tampon çözeltide bulunan proteinler molekül boyutu, şekli ve birim kütle başına düşen yük durumuna göre elektriksel alanda farklı hızlarda hareket edeceklerinden Elektroforetik yöntemlerden de enzim saflaştırılmasında yararlanılabilir. Özel durumlarda uygulanan bu teknikler ile protein veya enzimlerin gram düzeyinde saflaştırılması mümkündür.

Enzimlerin saflaştırılması ve izolasyonunu takiben elde edilen saf enzimin kurutulması, depolanması işlemleri uygulanır. Bu konunun ayrıntıları verilmeyecektir.

Bazı enzimlerin üretimi

α-amilaz Enziminin Üretimi:
alfa-amilaz (1,4- α- D glukan-glukonohidrolaz) enzimi ticari olarak kullanılan ilk enzimdir.  α-amilaz enzimi, nişasta molekülündeki α-1,4 bağlarını parçalayarak glikoz, maltoz ve dekstrinlerin oluşumunu sağlar. Nişasta, çok sayıda glikoz molekülünün farklı şekillerde bağlanmasıyla oluşmuş polisakkarit özellikte bir bileşiktir. Bazı bakteriler ve mantarlar tarafından üretilen α-amilaz,
β-amilaz,
glikoamilaz ve glikoizomeraz gibi enzimler nişastayı parçalama yeteneğine sahiptirler. Fungal α-amilazlar sıcaklığa bakteriyal α-amilazlardan daha az stabil olduğundan üzerinde çalışılan asıl enzim kaynağını daha çok bakteriyal; özellikle de Bacillus amilazları oluşturmaktadır. Bu cinsin özellikle 8 tanesinin sentezlediği α-amilaz
enzimi çeşitli
araştırıcılar tarafından tanımlanmış ve karakterize edilmiştir. Bunlar B. subtilis, B. amyloliquefaciens ve B. caldolytcus B. coagulans B.licheniformis B. Macerans B. stearothermophilus ve B. subtilis var. amylosacchariticus’dur. Termostabil α-amilazın uygulama alanı oldukça      genişlemiş ve çeşitlenmiştir. Bu enzimler tekstil ve kağıt endüstrisinde, nişastanın sıvılaştırılmasında, ekmek, glikoz ve fruktoz şurupları ve tutkal üretiminde, alkol fermentasyonunda kullanılmaktadırlar. Bira, damıtma, fırıncılık ve tekstil endüstrisinde kullanılan, Bacillus ve Aspergillus tarafından üretilen, ayrıca arpa ve buğday maltında da bulunabilen enzimler, amilaz ve endo β-glukanazlardır. Tekstil endüstrisinde dokuma sırasında ipliklerin sağlam ve düzgün olması ve kopmaması için iplikler nişasta içeren bir çözelti ile muamele edilmektedirler. Bu işleme haşıllama adı verilir. Kumaş dokunduktan sonra, kumaştaki fazla nişastanın uzaklaştırılması gerekir. Bu işleme de haşıl alma adı verilmektedir. Haşıl alma ajanı olarak da yaygın olarak α-amilaz enzimi
kullanılmaktadır. Gıda endüstrisinde, nişastanın α-amilaz enzimi ile hidrolize edilmesi sonucu açığa çıkan ürünler, yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bu ürünlerden dekstrin, nişastanın glikoza kadar hidrolize olmasından önce oluşan kısa moleküllü ilk üründür. Dekstrinler çözünürlüğü yüksek ve dayanıklı bir ürün olup, yoğun şurup kıvamında bir maddedir ve bu maddeler gıdalarda viskozite arttırıcı, yani, koyulaştırıcı dolgu maddesi olarak kullanılmaktadır. α-amilaz enzimi ekmekçilikte, ekmeğin bayatlamasını geciktirmesinden ve raf ömrünü uzatmasından (2-3 gün) dolayı yaygın olarak kullanılmaktadır. Meyve suyu endüstrisinde de uygulama alanı bulan enzim, özellikle elma ve armut sularının berraklaştırılmasında kullanılmaktadır. Meyveler tam olgunlaşmadan toplandığında meyvede hala nişasta bulunduğu için meyve suyunda bulanıklık meydana
gelmektedir. Bu sorun, ortama α- amilaz ilave edilerek giderilmektedir.

α-amilaz enzimi kesikli kültür yöntemi ile üretilir. Ortamda glikoz bulunmamalıdır (katabolik represyonun kontrolü için). Ticari üretimlerde mısır veya patates nişastası hammadde olarak kullanılır. Bu içeriğe soya küspesi ilave edilir. Azot desteği yapılır. Üretim beş gün sürer. Biyoreaktörde sıcaklık 40°C’de tutulur. Nötral pH ve etkili havalandırma gereklidir. Fermantasyon tamamlandıktan sonra reaktör soğutulur. Biyomas ve süspanse haldeki katı parçacıklar çöktürülerek uzaklaştırılır. Enzim solüsyonu uygulama amacına göre saflaştırılır ve konsantre edilir. Çoğu kez istenilmediği halde proteazlar da oluşabilir. Bu problem suş üzerinde yapılan çalışmalarla çözülebilir. Eğer biyoreaktörde proteazlar oluşmuşsa ısı uygulaması ile inaktive edilebilir (ısıya dirençli alfa amilaza zarar vermeden). Daha sonra α-amilaz enziminin stabilitesini artırmak için kalsiyum iyonları eklenerek sıvı veya katı formda satışa sunulur.

Amiloglikozidaz
enziminin üretimi:

Fungal Glukoamilaz’in gıda endüstrisinde genis bir kullanım alanı vardır. Nisasta dekstrinlere kadar parçalandıktan sonra glukoamilazın ortama ilavesi ile glukoza kadar ayrısmaktadır. Açıga çıkan glukoz ya surup halinde, ya da kristal toz halinde elde edilmektedir. Glukoz surubuna glukoz izomeraz enzimi katılarak yüksek fruktozlu surup üretimi saglanmaktadır. Bu ürün yüksek bir tatlılığa sahip olup, mesrubat üretiminde, süt ürünlerinde, ekmekçilik ürünlerinde, konservecilikte, pasta ve sekerleme yapımında yaygın olarak kullanılmaktadır. Glukoamilaz enzimi alkol üretiminde de kullanılmaktadır. Alkol üretiminde hammadde olarak kullanılan nisastalı materyaller alfa-amilaz ve glukoamilaz enzimleri ile muamele edilmektedir. Nisasta yeterince parçalandıktan sonra ortama maya aşılanarak fermentasyon islemine geçilmektedir. Meyva suyu endüstrisinde de uygulama alanı bulunmakta olup, özellikle elma ve armut sularının berraklastırılmasında kullanılmaktadır. Meyveler tam olgunlasmadan toplandıgından meyve halen nisasta ihtiva eder, bu durum ise
meyve sularında bulanıklıga yol açmaktadır. Bu sorun ortama glukoamilaz ve alfa-amilaz ilavesi ile giderilebilmektedir. Nisastadan fruktoz surubu (HFCS) üretiminde baslıca üç reaksiyon vardır: Nisastanın maltodekstrinlere parçalanması, maltodekstrinlerin glikoza hidrolizi, glukozun fruktoza izomerizasyonu. Enzimlerin optimum pH değerleri ve termal kararlılıkları farklı olduğundan, prosesin her basamağı farklı sıcaklıkta ve farklı tampon çözelti kullanılarak yapılır. Prosesde en uzun zaman gerektiren reaksiyon Glukoamilaz tarafından gerçeklestirilen reaksiyondur. Bazı çalısmalarda prosesin verimliligi artırmak amacıyla
Glukoamilaz enziminin katalitik aktivitesi solvent kullanılarak artırılmaya çalısılmıstır. Amiloglikozidazların ürün olarak sadece glikoz oluşturması bu enzimleri, α ve β-amilazdan ayırmaktadır. Hem α-1,4 bağlarını etkiler hem de yavaş bir hızla da olsa α-1,6 bağlarını hidroliz eder. Bu enzim funguslarda özellikle Aspergillus ve Rizopus’tan elde edilir. Diğer bir çok fungal enzimlerde olduğ gibi pH 4- 4.5 değerlerinde optimum çalışır.

Enzim dekstran içeren bir ortamda üretilir. Yabani suşlarda ortamda glikoz varsa enzim sentezi baskılanır. Seçilen fungal suşlar spor süspansiyonları hazırlanarak çoğaltılır ve yüksek oranda nişasta içeren (%20) üretim fermantörüne aktarılır. Nişasta, sistem sterilize edilirken alfa amilaz enzimi ile muamele edilir. Biyoreaktörde kesikli fermantasyon yöntemi uygulanır. Azot sınırlı tutulur. İnkübasyon 4-5 gün sürer. Ph 4,5 dolaylarında tutulmaya çalışılır. Fermantasyon sonunda miselyum filtre edilir ve ürün %5 aktif enzim içerecek şekilde konsantre edilir.

Glikozizomeraz enzimi üretimi: Ticari anlamda üretilen glikoz izomeraz enzimi aslında D- ksiloz- ketol izomeraz enzimidir. Bu enzim bir çok bakteri (Bacillus, Microbacterium, Arhrobacter)  ve miselli üreyen türler (Streptomyces, Actinoplanes) tarafından üretilir. Enzim üretiminde mikroorganizma ksiloz veya bitkisel hemiselüloz içeren ortamlarda çoğaltılır. Bazı suşlar ise bu enzimi glikoz içeren ortamlarda da üretebilmektedir.

Enzim üretimi kesikli kültür yöntemi ile iyice havalandırılan bir reaktörde 30°C’de, nötral pH’da 2-3 gün lük inkübasyon sonucunda üretilmektedir.

Fermentasyon sonucunda enzim içeren biyomas ayrılmakta ve ekstraksiyon ve saflaştırma basamaklarından sonra enzim üretilmektedir. Enzimin stabilitesini artırmak için immobilize formda hazırlanır. Enzim preperatına kobalt ve magnezyum ilavesi hem enzim stabilitesini artırır hem de depo şartlarında raf ömrü uzar (oksijenin etkisinden korunur). Ancak ticari uygulamalarda kobalt eklenmesi güvenlik açısından ve işlem sonrası kobaltı uzaklaştırmanın güçlüğünden dolayı pek tercih edilmez.

Bazı Enzim Uygulamaları

Nişasta Hidrolizi: Nişasta hidrolizi için %40 nişasta içeren çözelti105-110°C‘ye buhar yardımıyla ısıtılır. Bu ortamda nişasta jeli oldukça yüksek vizkoziteye sahip olup soğutulması ve işlenmesi oldukça zordur. Bu aşamada sıcağa dayanıklı α- amilaz enzimi ile beraber kalsiyum iyonları eklenerek verim artırılır. Bu aşamada kısmen hidrolize olan nişasta ikinci bir kez 90-100°C’de 1- 2 saat yeniden enzim ilavesine tabi tutulur. İşlemin etkinliği üzerinde sıcaklık profili, uygulama sıcaklığı, enzimin katalitik aktivitesi ve stabilitesi etkilidir. Daha az enzim kullanılacaksa uygulama süresi uzatılabilir. Ancak uygulamanın ortam vizkozitesini aşırı artırmamasına özen göstermek gerekir. Genellikle 1 lt enzim preperatı 1 ton nişasta için için kullanılır.

Glikoz şurubu üretimi:
Dekstrin solusyonlarından glikoz şurubu eldesi uzun reaksiyon zamanına ihtiyaç duyan kesikli yürüyen proseslerdir. %30- 40 şeker nişasta hidrolizi 60°C’ye soğutulur ve pH’sı 4,0’e ayarlanır. Uygun miktarda enzim ilavesinden sonra optimum sıcaklıkta 2-3 gün beklenir. Ortam sıcaklığı yüksek tutulursa enzim inaktive olabilir çok düşük tutulursa enzimatik dönüşüm tamamlanmayabilir ve bakteriyal kontaminasyon meydana gelebilir. Enzimin ürünle uzun süre muamelesi de istenmeyen yan ürünlerin oluşmasına neden olabilir. Bu yüzden üretimin sonunda enzimin asit veya ısı etkisiyle inaktive edilmesi gerekir. Bu olumsuzlukların giderilmesi için immobilize enzim uygulaması ile glikoz şurubu üretimi tercih edilmektedir. Nisasta prosesinin ilk basamagı olan nisastanın alfa- amilaz tarafından sıvılastırılması hızlıdır. Üretilen dextrin daha sonra glikoamilaz
eklenmeden önce 55-60°C’ye kadar soğutulması gerekir. Çünkü gilikoamilaz’ın termostabilitesi alfa- amilaz enzimine göre daha düsüktür. Bu sıcaklıkta glikoamilaz’ın bütün dextrini hidroliz etmesi birkaç gün sürer ve üretim için çok sayıda reaktöre ihtiyaç duyulur. Ancak immobilize glikoamilaz  kullanıldığında sürekli üretim yapılabildiğinden hem reaksiyon süresi kısalır hem de reaktör sayısı düser. Bu enzim (ekzo alfa- 1,4, D- glikozidaz)
Nişasta zincirinin ucundaki indirgen olmayan kısımdan, ardışık olarak glikoz birimlerini uzaklaştıran bir ekzoenzimdir.

Glikoz İzomerizasyonu: Glikozun eşit oranda (1:1) glikoz ve fruktoza dönüşümü tatlılığını artırır. Glikoz şurubu önce aktif kömürle muamele edilerek iyon değiştirme ve evaporasyon işlemlerinden geçirilerek enzimin inaktive olmasına neden olan oksijen ortamdan uzaklaştırılır. Daha sonra çözelti immobilize glikoz izomeraz enzimi içeren kolondan geçirilir. Çözeltinin şeker oranı %40 ve pH’sı 7-8 dolaylarında olmalıdır. Bu işlem sırasında sıcaklık 60°C’lerde tutulmalıdır. Rutin uygulamalarda kolondan geçirilen şeker çözeltisi oranı 0,25-1 hacim /reaktör hacmi/saat olmaktadır. Reaktör ömrü ise 2000-4000 saattir. 20 ton ürün için 1kg enzim kullanılması ideal olmakla birlikte şartlara göre miktar değişebilir

İmmobilize Enzimler

İmmobilizasyon: Suda çözünen ve çözeltide serbest hareket edebilen enzim moleküllerinin suda çözünmeyen destek görevi gören materyaller yardımıyla suda çözünmez forma dönüştürülmesi işlemidir. İmmobilize enzimlerin bir çok avantajı vardır. Örneğin: Enzimler tekrar tekrar kullanılırlar. Özellikle üretimi zor ve pahalı enzimler için bu önemlidir. Ürün enzimle kontamine olmaz, çünkü enzim matrikste tutulur. Matriks enzimi  fiziksel bir  bariyer olarak koruduğundan, enzim ekstrem pH ve temparatür gibi etkilere dayanıklı hale gelir. Sürekli fermentasyonlar için enzimi daha kullanışlı hale getirir. İmmobilize enzimler çok daha doğru bir şekilde kontrol edilirler. İmmobilize hücrelerle bir çok enzim de immobilize olacağından aynı anda birden fazla reaksiyon gerçekleşebilir. Reaksiyon sonunda ortamdan kolaylıkla uzaklaştırılabilirler. Ürün oluşumu kontrol altında tutulabilir. Enzimin katalitik gücü kaydadeger ölçüde stabilize edilmis olur. Üretim maliyeti düser.

Enzimleri immobilize etmek için bir çok yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemler şunlardır.

Kovalent bağlama: Enzimler kimyasal olarak kovalent bağlarla selüloz, sefadeks, agaroz, poliakrilamid, porlu seramik gibi suda çözünmeyen taşıyıcılara bağlanırlar.

Çapraz bağlama: Enzimler glutaraldehit, alifatik diaminler gibi bifonksiyonel reaktiflerle çapraz bağlanırlar. Bu reaktifler enzim molekülleri arasında bağ oluştururlar. Glutaraldehit enzim moleküllerinin amino gruplarından, diaminler ise karboksil gruplarından çapraz bağlarlar.

Adsorbsiyon: Enzim  moleküllerinin taşıyıcıların yüzeyine adsorblanmaları esasına dayanır. Kolay bir yöntemdir. Agaroz, sefadeks türevleri, selüloz türevleri, metal tuzları ve mineraller adsorban olarak kullanılırlar (Şekil 6.2).

Şekil 6.2. Adsorbsiyon

Tutuklama: Enzimler yapay ya da doğal polimer kafesleri içinde tutuklanırlar. Polimer kafesler içine substrat girer ve ürün dışarı çıkar. Çapraz bağlı poliakrilamid jeller, Ca alginat, kappa karragenan bu polimerlerin örneklerindendir. (şekil 2).

            Tutuklama                                                                 Kapsülleme

Şekil 6.3. Tutulama ve kapsülleme

 Kapsülleme: Enzimler çeşitli tipteki membranlar içine alınırlar. Bu membranlar yarı geçirgendir. Düşük molekül ağırlıklı substratı ve molekülleri geçirirler. Hegza metilen diamin mikrokapsüllemede kullanılar. Ayrıca bu yöntemlerin kombinasyonları da, tutuklama-çapraz bağlama, kapsülleme-çapraz bağlama gibi, enzim immobilizasyonunda kullanılır.

                        Kaynaklar

Ø Rengin Eltem Mikrobiyal fizyoloji ders notları

Ø Basic Biotechnology. John Bu’lock, Bjorn Kritiansen. Academic Press. Orlano, Florida. 1987.  

Ø Biotechnology. Wulf Crueger, Anneliese Crueger. A Textbook of Industrial Microbiology. 1989, second edition. Sinauer press.

Ø Lesson 1: Fermentation processes- types and stages of fermentation process. Rai University.

Ø  Modelling of a fed betch fermentation process. University of Oulu. Control Engineering Laboratory Report A No. 21. June 2003

Ø  İmmobilize glukoamilaz ile Maltodekstrinden glukoz üretimi Yıldız bozkurt Tez özeti.

Facebook Yorumları

Bir Cevap Yazın